식품의약품안전처 공고 제2017-289호

식품의 기준 및 규격 일부개정고시(안)

행정예고

2017. 8. 7.

식품의약품안전처

식품의약품안전처 공고 제2017-289호

｢식품의 기준 및 규격｣ (식품의약품안전처 고시 제2017-57호, 2017.6.30.)을 일부 개정함에 있어 국민에게 미리 알려 의견을 수렴하고자 그 취지, 개정 이유 및 주요 내용을 ｢행정절차법｣ 제46조에 따라 다음과 같이 공고합니다.

2017년 8월 7일

식품의약품안전처장

식품의 기준 및 규격 일부개정고시(안) 행정예고

1. 개정 이유

식품 오염물질 기준 적용 원칙을 정비하고, 중금속 규격 재평가 결과를 바탕으로 납 또는 카드뮴의 규격을 강화 또는 신설하고자 하며, 히스타민이 생성되기 쉬운 어류 중 섭취량이 많으나 기준이 설정되어 있지 않는 ‘방어’에 히스타민 규격을 신설함으로써 국민에게 안전한 식품을 공급하고자 함.

바이러스에 의한 식중독 발생이 지속됨에 따라 식품용수 중 식중독 바이러스 기준을 확대하여 식품안전관리를 강화하고자 함.

참기름과 들기름에 다른 식용유지를 혼합할 수 없도록 한 규정을 명확히 하고 새로이 규명된 발기부전치료제 유사물질을 규격에 신설하여 식품의 건전한 유통질서를 확립하고자 함. 식품원료 중 「야생생물 보호 및 관리에 관한 법률」에서 멸종위기종으로 등록된 품목 중 현재까지 양식된 사례가 없고 품목제조보고된 식품 중 식품원료로 사용된 이력이 없는 어류 3종을 식품원료 목록에서 삭제하여 멸종위기종을 보호하고자 함

국내외에서 사용되는 농약의 잔류허용기준을 신설․개정하여 과학적인 식품 안전관리를 하고자 함.

2. 주요 내용

가. 오염물질 기준 적용 원칙 정비[안 제1. 2. 4), 제2. 3. 5)]

1) 물질별로 따로 규정되어 있던 오염물질 기준 적용 원칙을 통합 정비

2) 농․임․축․수산물의 방사능 및 폴리염화비페닐(PCBs) 기준 적용 조항 신설

3) 기준 적용 여부가 명확하지 않은 가공식품의 중금속, 곰팡이독소, 패독소 등 오염물질 기준 적용 원칙 문구 정비

나. 식품용수 중 식중독 바이러스 기준 설정[안 제2. 3. 4) (2) 바, 제5. 2. 1) (2), 제7. 4.26∼4.31]

1) 바이러스에 의한 식중독 발생이 지속됨에 따라 식품용수 중 식중독 바이러스 기준을 확대하여 식품 미생물 안전관리 강화

2) 노로바이러스 외에도 A형·E형 간염바이러스, 로타바이러스 등 식중독 바이러스 5종의 관리 기준 마련

3) 식품용수 중 바이러스 검출에 필요한 관련 시험법 신설

다. 중금속의 규격 강화 및 신설[안 제2. 3. 5)의 (2)]

1) 식품의 중금속 기준․규격을 재평가한 결과, 납 또는 카드뮴의 노출점유가 높은 식품에 납 또는 카드뮴 기준을 강화 또는 신설

2) 과일류, 갑각류, 유지종실류의 납 규격 신설 및 개정

3) 근채류, 연체류, 해조류의 납, 카드뮴 규격 신설 및 개정

4) 우리나라 국민이 주로 섭취하는 식품의 중금속 안전관리 강화

라. 농약 잔류허용기준 적용방법 개정[안 제2. 3. 7) (1), (3)]

1) 식품 중 잔류농약의 효율적 안전관리를 위해 일본, 유럽연합 등에서 도입 중인 농약 허용물질목록 관리제도(Positive List System, PLS)를 국내에도 도입 필요

2) 농약 잔류허용기준이 설정되지 않은 경우, 일률기준(0.01 mg/kg 이하)을 적용할 수 있도록 근거조항을 신설하고 잔류허용 기준 설정이 면제될 수 있는 근거 정비

3) 잔류농약 안전관리 강화로 국민 건강 보호

마. 방어의 히스타민 기준 신설[안 제2. 3. 16)의 (1)]

1) 섭취량이 많고 알레르기 발생 이력이 높은 방어에 히스타민 규격의 관리 필요성 증대

2) 수산물의 히스타민 규격 적용 어류에 ‘방어’ 추가

3) 섭취량이 높고 알레르기 발생 이력이 있는 수산물의 안전관리 강화

바. 신규 규명된 발기부전치료제 유사물질 2종 및 불법 의약품 성분 5종 추가 신설[안 제2. 3. 9), 제7. 10.4, 제7. 10.7.3∼10.7.6]

1) 식품에 허용되지 않은 화학적 합성품의 관리로 식품의 건전한 유통질서 확립 필요

2) 신규 규명된 발기부전치료제 유사물질인 ‘이소프로필노르타다라필’과 ‘데스카본실데나필’을 발기부전치료제 목록과 시험법에 추가

3) 식품에 첨가되어서는 아니되는 물질로 요힘빈, 이카린, 센노사이드, 카스카로사이드, 페놀프탈레인 추가

4) 불법의약품성분이 식품에 함유되어 유통되는 것을 방지함으로써 안전한 식품이 유통될 수 있는 기반 마련

사. 참기름과 들기름의 정의 및 제조․가공기준 개정[안 제4. 7-1, 7-3]

1) 가짜참기름, 가짜들기름이 유통되는 것을 방지하여 식품의 건전한 유통질서를 확립하기 위하여 명확한 규정 필요

2) 식물성유지류의 제조․가공기준과 참기름과 들기름, 기타식용유지의 정의 개정

3) 가짜참(들)기름의 유통을 사전에 차단함으로써 식품의 건전한 유통질서 확립

아. 식품에 사용할 수 있는 원료 목록 개정[안 별표 1]

1) 「야생생물 보호 및 관리에 관한 법률」에 멸종위기종으로 지정되고 현재까지 양식기술이 확보되지 않은 생물의 보호 필요

2) 현행 식품원료로 인정된 것 중 멸종위기종으로 등록된 미흑점상어, 비악상어, 장완흉상어를 식품원료 목록에서 삭제

3) 멸종위기 야생생물을 식품원료로 사용할 수 없도록 금지함으로써 야생생물 보호

자. 농산물 중 농약 잔류허용기준 개정[안 별표 3 중 (1) 이미녹타딘, (5) 노르플루라존, (9) 델타메트린, (11) 멥틸디노캅, (12) 디디티, (15) 디설포톤, (18) 디캄바, (21) 디클로르보스, (26) 디페노코나졸, (28) 디펜아미드, (29) 디플루벤주론, (37) 메카밤, (46) 메틸브로마이드, (48) 바미도티온, (50) 베나락실, (52) 벤디오카브, (55) 뷰프로페진, (58) 비에치시, (61) 비펜트린, (63) 세톡시딤, (65) 사이로마진, (68) 사이할로트린, (71) 아미트라즈, (76) 알드린 및 디엘드린, (77) 알디카브, (83) 에티온, (85) 에토펜프록스, (88) 에트림포스, (90) 엔도설판, (91) 엔드린, (101) 이미다클로프리드, (106) 이피엔, (107) 키노메티오네이트, (108) 티오메톤, (110) 카두사포스, (112) 카벤다짐, (113) 카보페노티온, (114) 카보퓨란, (116) 카탑, (117) 캡타폴, (120) 퀸토젠, (124) 클로로벤질레이트, (125) 클로로탈로닐, (129) 클로르펜빈포스, (130) 클로르프로팜, (132) 클로르피리포스-메틸, (134) 터부트린, (135) 터부포스, (149) 트리플루미졸, (164) 펜발러레이트, (173) 포레이트, (176) 포스멧, (180) 플루실라졸, (181) 플루발리네이트, (182) 플루시트리네이트, (184) 프로메트린, (185) 프로사이미돈, (186) 프로클로라즈, (188) 프로파모카브, (191) 프로폭서, (192) 프로피코나졸, (198) 피페로닐부톡사이드, (202) 헵타클로르, (207) 테부페노자이드, (220) 디에토펜카브, (222) 메파니피림, (228) 아족시스트로빈, (229) 카프로파마이드, (232) 트리사이클라졸, (233) 펜사이큐론, (234) 펜피록시메이트, (238) 플루디옥소닐, (259) 피리메타닐, (291) 족사마이드, (294) 터부틸라진, (309) 플루톨라닐, (325) 사이아조파미드, (327) 오리사스트로빈, (362) 트리아자메이트, (370) 벤티아발리카브아이소프로필, (371) 디니코나졸, (373) 스피로메시펜, (374) 알라니카브, (375) 오퓨레이스, (376) 트리플루뮤론, (377) 티펜설퓨론메틸, (378) 페림존, (379) 플루아크리피림, (380) 피리달릴, (384) 사이플루페나미드, (386) 플로니카미드, (390) 시메코나졸, (391) 만디프로파미드, (393) 메트알데하이드, (394) 비스트리플루론, (395) 플루오피콜라이드, (396) 에티클로제이트, (399) 사이플루메토펜, (401) 디비이디시, (403) 메타플루미존, (404) 메트라페논, (405) 사이에노피라펜, (408) 스피네토람, (409) 아미설브롬, (410) 옥솔린산, (415) 크로마페노자이드, (416) 클로란트라닐리프롤, (417) 플루벤디아마이드, (419) 프로헥사디온-칼슘, (420) 린단]

1)「농약관리법」에 신규 등록 또는 수입 농산물에 농약 잔류허용기준 설정 신청에 따른 관련 기준 개정 필요

2) 이미녹타딘 등 농약 110종의 농약 잔류허용기준 개정

3) 농산물에 농약 잔류허용기준을 합리적으로 개정하여 국민에게 안전한 식품 공급

3. 의견 제출

「식품의 기준 및 규격」 일부개정고시(안)에 대하여 의견이 있는  단체 또는 개인은 2017년 10월 10일까지 다음 사항을 기재한 의견서를 식품의약품안전처장(우편번호 : 28159, 주소 : 충청북도 청주시 흥덕구 오송읍 오송생명2로 187 오송보건의료행정타운 식품의약품안전처, 참조 : 식품기준과, 전화 043-719-2417, 팩스 043-719-2400)에게 제출하여 주시기 바랍니다.

가. 예고사항에 대한 항목별 의견(찬․반 여부와 그 이유)

나. 성명(단체의 경우 단체명과 그 대표자의 성명), 주소 및 전화번호

다. 기타 참고사항

식품의약품안전처 고시 제2017-00호

「식품위생법」 제7조제1항에 따른 「식품의 기준 및 규격」(식품의약품안전처 고시 제2017-57호, 2017.6.30.)을 다음과 같이 개정 고시합니다.

2017년  00월  00일

식품의약품안전처장

식품의 기준 및 규격 일부개정고시(안) 행정예고

식품의 기준 및 규격 일부를 다음과 같이 개정한다.

제1. 2의 4)를 삭제하고, 5)～12)를 각각 4)～11)로 한다.

제2. 3. 4) (2) 바.를 다음과 같이 한다.

바. 식품접객업소 등의 식중독 바이러스 기준

식품접객업소, 집단급식소, 식품제조․가공업소 등에서 식재료 및 식기 등의 세척, 식품의 조리 및 제조․가공, 먹는 물 등으로 사용하는 물에서는 노로바이러스, A형·E형 간염바이러스, 로타바이러스, 아스트로바이러스, 장관아데노바이러스, 사포바이러스가 검출되어서는 아니 된다(단, 수돗물 및 염소 등으로 소독한 식품용수는 제외한다).

제2. 3. 5)의 ‘(1) 중금속 기준’을 ‘(2) 중금속 기준’으로 하고, (1)를 다음과 같이 신설한다.

5) 오염물질

(1) 오염물질의 기준 적용

① 건조 과정으로 인하여 수분함량이 변화된 건조 농․임․축․수산물의 중금속, 패독소, 폴리염화비페닐(PCBs) 기준은 수분함량의 변화를 고려하여 생물 기준으로 환산‧적용한다.

② 그대로 섭취하지 않는 건조 농․임․축․수산물의 방사능 기준은 수분함량의 변화를 고려하여 생물 기준으로 환산‧적용한다.

③ 기준이 별도로 설정되어 있지 않은 가공식품의 중금속, 곰팡이독소, 패독소 등 오염물질 기준은 원료의 함량에 따라 해당 농․임․축․수산물의 기준을 적용하고, 건조 등의 과정으로 인하여 수분 함량이 변화된 경우는 수분 함량을 고려하여 적용한다.

④ 기준이 설정되어 있는 가공식품 중 희석하여 섭취하는 식품의 중금속, 방사능, 다이옥신, 폴리염화비페닐(PCBs) 기준은 섭취시의 상태(제조사가 제시한 섭취방법)를 반영하여 적용한다.

제2. 3. 5)의 (2) 중금속 기준 ① 농산물 중 유지종실류, 과일류, 근채류의 납과 카드뮴 규격을 다음과 같이 한다.

대상식품		납(mg/kg)	카드뮴(mg/kg)
견과 종실류	유지 종실류	0.3 이하 (참깨, 들깨에 한한다)	0.2 이하 (참깨에 한한다.)
과일류		0.1 이하	0.05 이하
근채류		0.1 이하 (인삼, 산양삼은 2.0 이하, 도라지, 더덕은 0.2 이하)	0.1 이하 (양파는 0.05 이하, 인삼, 산양삼은 0.2 이하)

제2. 3. 5)의 (2) 중금속 기준 ③ 수산물 중 어류, 연체류, 갑각류, 해조류의 규격을 다음과 같이 한다.

대상식품	납(mg/kg)	카드뮴(mg/kg)	수은(mg/kg)	메틸수은(mg/kg)
어류	0.5 이하	0.1 이하 (민물 및 회유 어류에 한한다) 0.2 이하 (해양어류에 한한다)	0.5 이하 (심해성 어류, 다랑어류 및 새치류는 제외한다)	1.0 이하 (심해성 어류, 다랑어류 및 새치류에 한한다)
연체류	2.0 이하 (내장을 포함한 낙지는 2.0 이하, 오징어는 1.0 이하)	2.0 이하 (다만, 내장을 포함한 낙지는 3.0 이하, 오징어는 1.5 이하)	0.5 이하	-
갑각류	0.5 이하 (다만, 내장을 포함한 꽃게류는 2.0 이하)	1.0 이하 (다만, 내장을 포함한 꽃게류 는 5.0 이하)	-	-
해조류	0.5 이하 (미역에 한한다)	0.3 이하 [김(조미김 포함)에 한한다] 0.1 이하 (미역에 한한다)	-	-

제2. 3. 5) (1)의 ⑥을 삭제하고 종전의 ‘(2)～(7)’을 각각 ‘(3)～(8)’로 한다.

제2. 3. 5)의 (8)를 (9)로 하고 ③을 삭제하며, 제2. 3. 5)의 (9)를 (10)으로 한다.

제2. 3. 7) 농약의 잔류허용기준 중 (1)을 다음과 같이 한다.

(1) 농산물의 농약 잔류허용기준

① 농산물의 농약 잔류허용기준은 [별표 3]과 같다. 단, 개별 기준과 그룹 기준이 있을 경우에는 개별 기준을 우선 적용한다.

② 농산물에 잔류한 농약에 대하여 [별표 3]에 별도로 잔류허용기준을 정하지 않는 경우 0.01 mg/kg이하를 적용한다.

③ 「농약관리법」상 사용․등록된 농약 및 외국에서 해당 국가의 법률에 따라 합법적으로 사용되는 농약에 함유된 유효성분 중 아래의 사유에 해당되는 경우 잔류허용기준을 면제할 수 있으며, 면제 대상성분은 아래 표와 같다.

㉮ 독성이 현저히 낮아 인체 위해가능성이 없는 성분

㉯ 식품에 전혀 잔류되지 않는 성분

㉰ 자연계에 존재하여 해당 식품에 포함되어 있으므로 구분이 어려운 성분

㉱ 안전성이 확보된 천연식물보호제(미생물 등 포함) 성분

번호	유 효 성 분
1	1-메틸사이클로프로펜(1-Methylcyclopropene)
2	기계유(Machine oil)
3	데실알코올(Decylalcohol)
4	모나크로스포륨타우마슘케이비시3017(Monacrosporium thaumasium KBC3017)
5	바실루스서브틸리스디비비1501(Bacillus subtilis DBB1501)
6	바실루스서브틸리스시제이-9(Bacillus subtilis CJ-9)
7	바실루스서브틸리스엠 27(Bacillus subtilis M 27)
8	바실루스서브틸리스엠비아이600(Bacillus subtilis MBI600)
9	바실루스서브틸리스와이1336(Bacillus subtilis Y1336)
10	바실루스서브틸리스이더블유42-1(Bacillus subtilis EW42-1)
11	바실루스서브틸리스제이케이케이238(Bacillus subtilis JKK238)
12	바실루스서브틸리스지비365(Bacillus subtilis GB0365)
13	바실루스서브틸리스케이비401(Bacillus subtilis KB401)
14	바실루스서브틸리스케이비시1010(Bacillus subtilis KBC1010)
15	바실루스서브틸리스큐에스티713(Bacillus subtilis QST713)
16	바실루스아밀로리퀴파시엔스케이비시1121(Bacillus amyloliquefaciens KBC1121)
17	바실루스푸밀루스큐에스티2808(Bacillus pumilus QST2808)
18	보르도혼합액(Bordeaux mixture)
19	뷰베리아바시아나지에이치에이(Beauveria bassiana GHA)
20	뷰베리아바시아나티비아이-1(Beauveria bassiana TBI-1)
21	비티아이자와이(Bacillus thuringiensis subsp. aizawai)
22	비티아이자와이엔티423(Bacillus thuringiensis subsp. aizawai NT0423)
23	비티아이자와이지비413(Bacillus thuringiensis subsp. aizawai GB413)
24	비티쿠르스타키(Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki)
25	비티쿠르스타키(Bacillus thuringiensis var. kurstaki)
26	석회황(Calcium polysulfide, lime sulfur)
27	스트렙토마이세스고시키엔시스더블유와이이324(Streptomyces goshikiensis WYE324)
28	스트렙토마이세스콜롬비엔시스더블유와이이20(Streptomyces colombiensis WYE20)
29	스프레더스티커(Spreader sticker)
30	폴리에틸렌메틸실록세인(Polyethylene Methyl Siloxane)
31	아이비에이(IBA, 4-indol-3-ylbutyric acid)
32	아이에이에이(IAA, Indol-3-ylacetic acid)
33	알킬설폰화알킬레이트의나트륨염(Sodium salt of alkylsulfonated alkylate)
34	알킬아릴폴리에톡시레이트(Alkyl aryl polyethoxylate)
35	암펠로마이세스퀴스콸리스에이큐94013(Ampelomyces quisqualis AQ94013)
36	옥시에틸렌메틸실록세인(Oxyethylene methyl siloxane)
37	지베렐린류(Gibberellin A3, Gibberellin A4+7)
38	칼슘카보네이트(Calcium carbonate)
39	코퍼설페이트베이식(Copper sulfate basic)
40	코퍼설페이트트리베이식(Copper sulfate tribasic)
41	코퍼옥시클로라이드(Copper oxychloride)
42	코퍼하이드록사이드(Copper hydroxide)
43	트리코델마하지아늄와이씨 459(Trichoderma harzianum YC 459)
44	패니바실루스폴리믹사에이시-1(Paenibacillus polymyxa AC-1)
45	패실로마이세스퓨모소로세우스디비비-2032(Paecilomyces fumosoroseus DBB-2032)
46	폴리나프틸메탄설폰산디알킬디메틸암모니움염(Polynaphthyl methane sulfonic acid dialkyl dimethyl ammonium(PMSAADA))
47	폴리에테르폴리실록세인(Polyether modified polysiloxane)
48	폴리옥시에틸렌메틸폴리실록세인(Polyoxyethylene methyl Polysiloxane)
49	폴리옥시에틸렌알킬아릴에테르(Polyoxyethylene alkylarylether)
50	폴리옥시에틸렌지방산에스테르(Polyoxyethylene fatty acid ester(PFAE))
51	황(Sulfur)
52	니즈(polynaphtyl methane sulfonic + polyoxyethylene fatty acid ester)
53	소듐리그노설포네이트(Sodium ligno sulfonate)
54	심플리실리움라멜리콜라비씨피(Simplicillium lamellicola BCP)
55	트리코더마아트로비라이드에스케이티-1(Trichoderma atroviride SKT-1)
56	파라핀, 파라핀오일(Paraffin, Paraffinic oil)
57	펠라르곤산(Pelargonic acid)
58	에틸포메이트(Ethyl formate)

제2. 3. 7) (2)를 삭제하고, (3)∼(4)를 각각 (2)∼(3)으로 하며, (3)을 다음과 같이 한다.

(3) 가공식품의 잔류농약 잠정기준적용

가공식품에 잔류한 농약에 대하여 [별표 3]에 별도로 잔류허용기준을 정하지 않은 경우 다음을 적용한다.

① 원료식품의 잔류허용기준 범위이내에서 잔류를 허용할 수 있다. 즉, 원료의 함량에 따라 원료 농산물 및 축산물의 기준을 적용하고, 건조 등의 과정으로 인하여 수분 함량이 변화된 경우는 수분 함량을 고려하여 적용한다. [단, 건고추(고춧가루 및 실고추 포함)는 고추의 7배, 녹차 추출물은 차의 6배, 건삼 및 홍삼은 수삼의 4배, 인삼농축액 및 홍삼농축액은 수삼의 8배 농약잔류허용기준을 적용한다]

제2. 3. 7) 중 (5)∼(6)을 각각 (4)∼(5)로 한다.

제2. 3. 9)의 (1)의 ① 중 51과 52를 다음과 같이 신설한다.

번호	물질명
51	이소프로필노르타다라필(Isopropylnortadalafil)
52	데스카본실데나필(descarbonsildenafil)

제2. 3. 9)의 (1)의 ④ 중 7～11을 각각 다음과 같이 한다.

④ 기타 의약품 성분 등

번호	물질명
7	페놀프탈레인(phenolphthaleine)
8	요힘빈(yohimbine)
9	이카린(icarine)
10	센노사이드(sennoside)
11	카스카로사이드(cascaroside)

제2. 3. 16)의 (1) 중 ‘물치다래에’를 ‘물치다래, 방어에’로 한다.

제4. 7. 7-1 1) 중 ‘미강유, 참기름, 추출참깨유, 들기름, 추출들깨유, 홍화유’를 ‘미강유, 참기름, 들기름, 홍화유’로 한다.

제4. 7. 7-1 중 3)의 (4)와 (6)을 각각 다음과 같이 한다.

(4) 참기름과 들기름에는 다른 식용유지를 일절 혼합하여서는 아니 된다.

(6) 향미유 제조시 참깨, 들깨 또는 이들로부터 유래한 유지를 사용하여서는 아니 된다(다만, 식품첨가물 제외).

제4. 7. 7-1 중 4)의 (6)과 (8)을 삭제하고 종전의 (5) 참기름과 (7) 들기름을 각각 다음과 같이 한다.

(5) 참기름

참깨로부터 채취한 원유를 식용에 적합하도록 처리한 것을 말한다.

(6) 들기름

들깨로부터 채취한 원유를 식용에 적합하도록 처리한 것을 말한다.

제4. 7. 7-1 중 종전의 (9)～(16)을 각각 (7)～(14)로 하며 종전의 (17)을 다음과 같이 한다.

(15) 기타식물성유지

단일 식물성 원료로부터 채취한 원료유지를 식용에 적합하도록 처리한 것으로 상기의 (1)～(14)의 식품유형에 해당되지 않는 것을 말한다.

제4. 7. 7-1 5) 중 추출참깨유와 추출들깨유의 규격을 삭제하고, 참기름과 들기름의 규격을 다음과 같이 한다.

유형

항목

참기름

들기름

(1) 산가

0.6 이하

(압착유는 4.0 이하)

0.6 이하

(압착유는 5.0 이하)

(2) 요오드가

103~118

160~209

(3)산화방지제

(g/kg)

-

다음에서 정하는 것 이외의 산화방지제가 검출되어서는 아니 된다.

부틸히드록시아니솔 디부틸히드록시톨루엔 터셔리부틸히드로퀴논	0.2 이하 (병용할 때에는 부틸히드록시아니솔, 디부틸히드록시톨루엔 및 터셔리부틸히드로퀴논으로서의 사용량의 합계가 0.2 이하)
몰식자산프로필	0.1 이하

(4) 리놀렌산(%)*

0.5 이하

-

(5) 에루스산(%)

검출되어서는 아니 된다.

-

* 팔미트산(C16:0), 스테아르산(C18:0), 올레산(C18:1), 리놀레산(C18:2), 리놀렌산(C18:3), 아라키딘산(C20:0) 중 리놀렌산 함량

제4. 7. 7-3 3)의 (1)을 다음과 같이 신설한다.

(1) 참기름과 들기름에는 다른 식용유지를 일절 혼합하여서는 아니 된다.

제4. 7. 7-3 4)의 (1) 중 ‘압착한 참기름, 압착한 들기름’을 ‘참기름, 들기름’으로 한다.

제4. 7. 7-3 4)의 (2) 중 ‘압착참기름, 초임계추출참기름, 압착들기름, 초임계추출들기름은 제외’를  ‘참기름, 들기름은 제외’로 한다.

제4. 7. 7-3 4)의 (8) 중 ‘압착한 참기름, 압착한 들기름은’을 ‘참기름, 들기름은’으로 한다.

제5. 2. 1) (2)를 다음과 같이 한다.

(2) 원료 및 기구 등의 세척, 식품의 조리, 먹는물 등으로 사용되는 물은「먹는물 관리법」의 수질기준에 적합한 것이어야 하며, 노로바이러스, A형·E형 간염바이러스, 로타바이러스, 아스트로바이러스, 장관아데노바이러스, 사포바이러스가 검출되어서는 아니 된다(단, 수돗물 및 염소 등으로 소독한 식품용수는 제외한다).

제7. 4.26을 다음과 같이 신설한다.

4.26 식품용수 등의 A형 간염바이러스

가. 시약 및 시액

1) 2% 티오황산나트륨(Sodium thiosulfate: Na2S2O3) 용액

4,800 mL의 증류수에 티오황산나트륨 100 g을 녹여 최종 5,000 mL의 용액을 제조하고 121℃, 15분간 고압증기 멸균한다.

2) 1M 염산(HCl) 용액

1M 염산(HCl) 용액은 식품용수 채수 시 검체의 pH를 조정하는데 사용한다.

3) 1.5% Beef extract(desiccated powder) 용액

1,900 mL의 증류수에 Beef extract 분말 30 g과 glycine 7.5 g(최종농도 = 0.05 M)을 넣고 1M  NaOH를 이용하여 pH 9.5로 조정한 후 최종 2 L로 제조하고 121℃, 15분간 고압증기 멸균한다. Beef extract 용액은 4℃에서 일주일간 혹은 -20℃에서 장기간동안 보관할 수 있다.

4) 0.15 M 인산일수소나트륨, 7수화물(Sodium phosphate, dibasic, (Na2HPO4  7H2O)) 용액

950 mL의 증류수에 Sodium phosphate 40.2 g을 넣고 1M  NaOH를 이용하여 pH 9.5로 조정한 후 최종 1 L로 제조하고 121℃, 15분간 고압증기 멸균한다.

5) 1M 수산화나트륨(NaOH) 용액

400 mL의 증류수에 20 g의 수산화나트륨을 넣고 최종 500 mL로 제조하여 수산화나트륨 용액을 준비한다. 수산화나트륨 용액은 상온에서 수개월 동안 보관할 수 있다.

6) 바이러스 유전자 추출 키트(Viral RNA Mini Kits)

시판되는 바이러스 RNA 추출 키트(kit)를 사용한다.

※ 재현성 및 검출효율 등을 고려하여 QIAGEN-Viral RNA Mini Kits 또는 동등 이상의 제품사용 가능

나. 장치 및 기구

1) 검체 채수과정

가) 표준필터장치：식품용수 1,500∼1,800 L을 채수하는 장치

구성 : 용수 유입구, 단일주입기, 유량조절밸브, 압력게이지, 탈리액 주입구, 양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter), 카트리지 하우징(cartridge housing), 탈리액 유출구, 유량계, 용수 유출구

※ 양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter) : 1-MDS, NanoCeram 또는 이와 동등한 것

나) 휴대용 pH 측정기：식품용수의 수소이온농도를 측정한다.

다) 휴대용 탁도 측정기：식품용수의 혼탁도를 측정한다.

라) 휴대용 염소 농도 측정기：식품용수의 잔류염소농도를 측정한다.

마) 휴대용 아이스박스：식품용수 채수 후 양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter)를 운반하기 위해 사용한다.

바) 상업용 얼음팩：양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter) 운반 시 냉장상태 유지용으로 사용한다.

사) 기타：공구상자, 2 L 멸균 비커, 멸균된 알루미늄박, 클램프, 바이러스시료 검체기록부, 멸균장갑, 수은온도계, 멸균 메스실린더, 채수용 호스

ⓐ 용수 유입구 ⓑ 단일주입기 ⓒ 유량조절밸브 ⓓ 압력게이지 ⓔ 탈리액 주입구 ⓕ 감압단추 ⓖ 양전하 카트리지 필터 ⓗ 카트리지 하우징 ⓘ 탈리액 유출구 ⓙ 유량계 ⓚ 용수 유출구

《표준필터장치》

2) 바이러스 탈리과정

가) 연동정량펌프：1.5% 양전하 카트리지 필터로 유입시켜 흡착된 바이러스를 탈리하기 위한 장치

나) 연동정량펌프 탈리액 유입용 호스, 탈리액 유출용 호스

다) 자석교반기 및 자석교반 막대

라) 하우징 거치대, 탈리액 유입구, 탈리액 유출구, 압력게이지

3) 바이러스 농축과정

가) 원심분리기(4 ℃, 2,500∼10,000 G)

나) 원심분리용기(50∼500 mL 용량)

다) 0.22 μm 주사기 필터(30 mL 용량)

다. 시험방법

1) 식품용수 채수

채수할 때는 멸균된 장갑을 착용하여 바이러스가 오염되지 않게 주의하고 오염이 될 수 있는 환경요인들을 피하여야 한다. 멸균된 장갑이 사람의 피부나 오염 가능성이 있는 장치, 부품에 접촉이 되었을 경우 장갑을 바꿔 착용한다(예: 수도꼭지나 다른 환경요소 표면).

가) 채수하려는 검체의 배출구(수도꼭지 등)를 2～3분 정도 열고 식품용수를 흘려보낸다. 배출구에 채수호스를 장착 시 누수가 되지 않도록 클램프를 이용하여 단단히 연결하고 탁도가 균일할 때까지 흘려보낸 후 배출구를 잠근다.

나) 염소계소독제(예, HOCl 등)나 불꽃버너를 이용하여 배출구(수도꼭지 등)를 살균 또는 가열한다.

다) 채수용 호스의 알루미늄박을 제거한 후 채수 할 배출구에 연결하고 표준필터장치 용수 유입구(ⓐ)에 호스를 연결한다. 이 단계에서 양전하 카트리지 필터(ⓖ)는 연결하지 않는다.

라) 천천히 배출구를 열어 압력게이지가 200 kPa(30 PSI)가 넘지 않도록 배출구를 조절하고 76 L(20 gal)의 식품용수를 흘려보낸다.

마) 식품용수 76 L를 흘려 보낸 후 일부를 2 L 멸균 비커에 받아 용수의 탁도, pH, 온도, 염소농도를 각 각 측정하여 검체번호, 채수위치, 채수자의 이름과 함께 바이러스 검체채수기록부에 기록한다. pH 측정기는 사용 전 보정(calibration) 한다.

바) 용수 배출구(수도꼭지 등)를 잠그고 검체가 다음의 조건에 해당되어 부가장치의 연결이 필요한지의 여부를 결정하여 연결한다.

(1) pH 8이상일 경우 멸균된 튜브로 단일주입기(ⓑ)와 1 M 염산 용액이 담긴 메스실린더를 연결하고, 배출구(수도꼭지 등)를 다시 열어 용수의 pH가 6.5～7.5가 되도록 단일 주입기를 통해 1 M 염산 용액을 흘려보낸다. 용수유출구(ⓚ)로 흘러나온 용수의 pH를 측정해 바이러스 검체 채수기록부에 기록한다.

(2) 잔류염소 제거를 위해 위와 같이 단일주입기를 연결하여 식품용수 3.8 L(1 gal) 당 2% 티오황산나트륨 용액 10 mL이 주입되도록 한다.

* (1)와 (2)번이 모두 해당할 경우 이중주입기를 연결하여 사용한다.

사) 바이러스검체 채수기록부에 검체 채취일, 시작 시간, 유량계의 초기 수치를 기록한다.

아) 알루미늄박을 제거한 양전하 카트리지 필터를 탈리액 주입구(ⓔ)와 유출구(ⓘ) 사이에 연결한다.

자) 용수를 천천히 흐르게 하면서 카트리지 하우징 상단의 감압단추(ⓕ,vent button)를 눌러 내부공기가 완전히 빠지도록 한 후, 수도꼭지를 완전히 열어 준다.

차) 압력게이지가 200 kPa(30 PSI) 이하로 유지되도록 유량조절 밸브를 조정하고 식품용수 1,500～1,800 L를 통과시킨 후, 용수 배출구(수도꼭지 등)를 잠근다.

카) 바이러스 검체 채수기록부에 검체채취 종료일, 종료 시간, 유량계의 최종 수치 등을 기록한다.

타) 표준필터장치로부터 카트리지 하우징(ⓗ)을 분리하고 양전하 카트리지 필터를 거꾸로 하여 남은 물을 버린 후 하우징 양끝의 연결된 개구부를 멸균된 알루미늄박으로 싼다.

파) 양전하 카트리지 필터를 아이스박스에 담고 얼음팩 등을 사용하여 냉장상태(냉동시켜서는 아니 된다)로 유지하여 즉시 실험실로 운반한다.

2) 바이러스 탈리과정

가) 냉장 보관하여 운반한 필터는 채수 시작 시간부터 24시간 내에 실험실에서 바이러스 탈리 시험을 실시하여야 한다. 다만, 부득이한 경우로 인해 24시간 내에 탈리시험이 불가할 경우 최대 72시간이 넘지 않도록 한다.

나) 탈리용 거치대에 카트리지 하우징을 장착한 후 유량조절 밸브를 모두 닫는다.

다) 탈리액 주입구에 연동정량펌프 호스를 연결한 후 연동정량펌프와 1.5% Beef extract 용액이 채워져 있는 유리병에 호스를 차례로 연결하되, 1-MDS 필터는 1 L, NanoCeram 필터에는 0.5 L의 1.5% Beef extract 용액을 사용한다.

라) 탈리액 유출구에 유출용 호스를 연결하여 1.5% Beef extract 용액이 들어 있는 유리병에 넣고 탈리액 유출구를 닫는다.

마) 연동정량펌프를 가동하여 양전하 카트리지 필터 하우징 안으로 1.5% Beef extract 용액이 양전하 카트리지 필터 내에 완전히 차도록 한 후 감압단추를 통해 1.5% Beef extract 용액이 넘쳐 흘러나오기 시작하면 감압단추에서 손을 떼고, 연동정량펌프 가동을 멈춘 후 5분간 정치한다.

※ 감압단추는 탈리액이 양전하 카트리지 필터 안으로 가득 채워질 때까지 눌러준다.

바) 탈리액 유출구를 열고 연동정량펌프를 다시 가동한 후 하우징에 채워져 있는 1.5% Beef extract 용액이 서서히 필터를 통과하도록 한다. 통과한 완충액은 1.5% Beef extract 용액이 들어있던 유리병에 수집한다. 탈리액을 회수할 때는 거품이 없도록 주의하여야 한다.

※ 연동정량펌프 대신 양압펌프와 압력통을 사용하여 탈리과정을 진행할 수도 있다.

사) 유리병에 수집된 탈리액은 라)～바)의 과정을 2회 반복한다.

아) 최종 탈리액은 1 M 염산 용액으로 pH를 7.0～7.5 사이로 조절하고 멸균된 메스실린더를 사용하여 부피를 기록한다.

자) 탈리액은 24시간 이내에 농축시험이 가능할 경우 4℃에서 보관하며, 농축 시험을 즉시 시행하기 어려울 때에는 -70℃에서 보관한다.

3) 바이러스 농축과정

가) 최종 탈리액을 교반기에서 혼합하면서 1 M 염산용액으로 pH를 3.5±0.1로 조절한 후, 실온에서 30분간 천천히 섞는다.

나) 침전물이 생기면 탈리액을 멸균한 원심분리용기에 옮겨 원심분리한다(2,500 G 15분, 4℃).

다) 원심분리 후, 상등액을 제거하고 남은 침전물에 0.15 M sodium phosphate 완충액(pH 9.0～9.5)을 20～30 mL 넣어 완전히 부유 시킨 후 실온에 10분간 방치한다.

라) 부유시킨 용액을 원심분리한다(7,000 G, 10분, 4℃).

마) 상등액을 취해 1 M 염산용액으로 pH 7.0～7.5로 조절한다.

바) 미생물오염을 방지하기 위해 30 mL 주사기를 이용하여 상등액을 0.22 μm 주사기 필터로 여과한다. 검체 중의 바이러스가 필터에 흡착되는 것을 방지하기 위하여 사전에 0.22 μm 주사기 필터에 10～20 mL의 1.5% Beef extract 용액(pH 7.0～7.5)을 통과시킨다.

사) 최종 농축 검체량(FCSV, final concentrated sample volume)을 기록하고 검체를 24시간 이내에 분석할 경우는 4℃에 보관하고 나머지는 분석 전까지 -70℃에 보관한다.

아) 최종 농축검체 20～30 mL는 바이러스 유전자 추출을 위한 검체로 사용한다.

4) 바이러스 유전자 추출 과정

시판되는 바이러스 RNA 추출 키트(kit)를 사용하며, 제조사가 제시하는 적절한 실험법에 따라 실시한다.

※ 재현성 및 검출효율 등을 고려하여 QIAGEN-Viral RNA Mini Kits 또는 동등 이상의 제품이 사용이 가능하며, 또한 자동유전자 추출장치를 사용할 경우에도 바이러스 RNA 추출 키트를 사용하여 바이러스 유전자를 추출할 수 있다.

가) 바이러스 유전자 추출 시 검체와 동일한 과정으로 음성대조군(negative control)을 사용하여 유전자를 추출하며 검체의 경우 시험 진행 중 오염 여부를 확인하기 위해 2개의 RNA를 추출한다.

나) 검체 농축액과 음성대조군 각 280 μL에 AVL 완충액(guanidine thiocyanate 함유) 1,120 μL를 각각 혼합하여 실온에서 10분 동안 방치한 후 가볍게 원심분리기를 이용하여 원심분리(spin-down)한다.

다) 여기에 95～100% 에탄올 1,120 μL을 넣어 혼합한 후 가볍게 원심분리(spin-down)한다.

라) 혼합액 630 μL을 소량 원심(Mini spin) 컬럼으로 옮겨 6,000 G에서 1분간 원심분리하고 컬럼을 새로운 회수용(collection) 튜브로 옮긴 다음 남은 혼합액을 630 μL씩 동일한 방법으로 컬럼에 첨가하여 원심분리한다.

마) 소량 원심(Mini spin) 컬럼을 새로운 회수용(collection) 튜브로 옮겨 AW1 완충액(guanidine hydrochloride 함유) 500 μL을 넣고 6,000 G로 1분간 원심분리 후 컬럼을 새로운 회수용(collection) 튜브로 옮긴다.

바) AW2 완충액 500 μL을 넣고 20,000 G로 3분간 원심분리한 후 컬럼을 새로운 1.5 mL 회수용(collection) 튜브로 옮긴다.

사) AVE 완충액(sodium azide 함유) 60 μL를 넣고 6,000 G로 1분간 원심분리하여 다음의 RT-PCR(Reverse transcription-Polymerase chain reaction)을 수행하기 위한 주형(template)으로 사용한다.

5) A형 간염바이러스 유전자 PCR 과정 및 결과판정

RT-PCR(Reverse transcription-PCR)과정에서는 A형 간염바이러스를 인위적으로 조합하여 합성한 RNA 등을 PCR 양성대조군으로 사용할 수 있다.

가) One-step RT-PCR(Reverse transcription-PCR) 방법은 아래와 같이 수행한다.

(1) PCR 조성조건은 표 1과 같이 Mastermix(2X) 25 μL, Reverse transcriptase (50unit/μL) 1 μL, 프라이머(HAV1, HAV2)는  각 2 μL, 추출 RNA 5 μL를 첨가하여 증류수로 총 50 μL로 맞추고 반응시킨다.

(2) PCR 반응조건은 표 2와 같이 48℃에서 40분, 95℃에서 4분 DNA를 변성시키고, 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초를 1회로 하여 30회 반응시킨 후, 72℃에서 7분간 연장 반응시킨다. 상기 반응 종료 후 PCR 생성물에 대하여 Nested PCR을 실시한다.

표 1. A형 간염바이러스 One-step RT-PCR(Reverse transcription-PCR) 반응액 조성

Component	Volume	Primers
Mastermix(2X)	25 μL	-
Reverse transcriptase(50unit/μL)	1 μL	-
D.W.	15 μL	-
Forward primer(20pmol)	2 μL	HAV1
Reverse primer(20pmol)	2 μL	HAV2
Extracted RNA, PCR control	5 μL	-
Total	50 μL	-

표 2. A형 간염바이러스 One-step RT-PCR(Reverse transcription-PCR)  반응조건 및 온도

	온도	시간	Cycle
cDNA 합성(cDNA synthesis) 초기 변성(predenaturation)	48℃ 95℃	40 min 4 min	1 cycle
변성(denaturation) 결합(annealing) 확장(extension)	95℃ 55℃ 72℃	30 sec 30 sec 30 sec	30 cycles
최종신장(post-elongation)	72℃	7 min	1 cycle
보관	4℃	∞	∞

나) Nested PCR 방법은 아래와 같이 수행한다.

(1) One-step RT-PCR(Reverse transcription-PCR) 산물을 주형으로 하여 표 3과 같이 Nested PCR을 실시한다. 1차 PCR산물 5 μL, 10x 완충액(MgCl2 포함) 5 μL, dNTPs(10 mM) 4 μL, Taq DNA polymerase(5 unit/μL) 1 μL, 프라이머(HAV3, HAV4)는 각 2 μL 첨가한 다음 최종 증류수로 총 50 μL로 맞춘 후 Nested PCR을 실시한다.

(2) PCR 반응조건은 표 4와 같이 95℃에서 4분간 DNA를 변성시키고 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초를 1회로 하여 30회를 반응시킨 후 72℃에서 7분간 연장 반응시킨다.

표 3. A형 간염바이러스 Nested PCR 반응액 조성

Component	Volume	Primers
dNTPs(10mM)	4 μL	-
10x Buffer(with MgCl2)	5 μL	-
D.W.	31 μL	-
Forward primer(20 pmol)	2 μL	HAV3
Reverse primer(20 pmol)	2 μL	HAV4
Taq DNA polymerase(5 unit/μL)	1 μL	-
1st PCR Product	5 μL	-
Total	50 μL

표 4. A형 간염바이러스  Nested PCR 반응조건 및 온도

	온도	시간	cycle
초기 변성 (predenaturation)	95℃	4 min	1 cycle
변성(denaturation) 결합(annealing) 확장(extension)	95℃ 55℃ 72℃	30 sec 30 sec 30 sec	30 cycles
최종신장(post-elongation)	72℃	7 min	1 cycle
보관	4℃	∞	∞

(3) PCR 반응 종료 후 PCR 증폭 반응액 5 μL를 전기영동 완충액(gel loading buffer) 1 μL와 혼합한 다음 젤(gel)의 각 홈에 검체를 조심스럽게 넣고 나머지 한 홈에 PCR 증폭산물의 크기를 식별하기에 적당한 표식 DNA(marker DNA) 7 μL를 넣는다. 1.5% 아가로스 젤(agarose gel) 상에서 100V로 전기영동한 후 Ethidium Bromide(EtBr) 염색액(10 mg/mL)으로 30분간 염색한 후 증류수로 10분간 탈색하고 자외선 조사기(UV transilluminator)로 조사하여 증폭된 DNA 밴드를 관찰한다.

(4) A형 간염바이러스 유전자 증폭에 사용하는 프라이머는 표 5와 같다.

표 5. A형 간염바이러스 PCR 프라이머 염기서열

Primer	Sequence(5'→3')	Application	PCR Size(bp)
HAV1	GCT CCT CTT TAT CAT GCT ATG GAT	One-step RT-PCR	244
HAV2	CAG GAA ATG TCT CAG GTA CTT TCT
HAV3	ATG TTA CTA CAC AAG TTG GAG AT	Nested PCR/ Sequencing	186
HAV4	GAT CCT CAA TTG TTG TGA TAG CT

다) 1차 결과 확인

(1) 아가로즈 젤(agarose gel)상에서 시료에 PCR 증폭산물이 186 bp(또는 244)의 밴드가 있을 경우 A형 간염 바이러스로 일차 확인한다.

(2) 만일 음성대조군(negative control)에서 PCR 밴드가 확인이 될 경우 등은 재시험을 실시해야한다(표 6 참고).

(3) A형 간염바이러스가 일차 확인된 경우 최종 확인을 위하여 아가로스 젤(agarose gel)상에서 해당부위를 절취하여 PCR 산물을 정제한 후 염기서열(DNA sequencing)을 분석하여 최종 판정한다.

표 6. A형 간염바이러스 PCR 결과판정(예시)

	추출 RNA(시료)	음성대조군	1차 판정
1	+	-	PCR 검출
	+
2	+	-	PCR 검출
	-
3	+	+	재 실험
	+
4	-	-	PCR 불검출
	-

+ : A형 간염바이러스 PCR 밴드 확인됨,  - : 밴드가 확인되지 않음

라) 최종 검출 판정

(1) 염기서열 분석(DNA sequencing)을 위하여 다)의 (3)에서 정제된 DNA 1 μL를 주형으로  HAV3과 HAV4 프라이머를 사용한다.

(2) 염기서열 분석(sequencing) 반응을 위한 혼합 조건은 각 유전자형 Nested 프라이머(primer, 1 pmol)를 독립된 각각의 튜브에 2 μL, dye-terminator 2 μL, 정제 DNA 2 μL를 첨가하여 증류수로 최종 10 μL가 되도록 하고 96℃에서 1분간 DNA를 변성시킨 후, 96℃에서 10초간, 50℃에서 5초간, 60℃에서 4분간을 1회로 하여 25회 반응시킨 다음 60℃에서 10분간 연장반응을 시킨다.

(3) PCR 산물은 염기서열 분석(DNA sequencing)하되 2종 이상의 유전자가 혼합되어 있는 경우에는 클로닝 염기서열 분석(Cloning DNA sequencing)을 재실시 한다. 염기서열 분석(DNA sequencing)에 의해 결정된 염기서열은 A형 간염바이러스 유전자 데이터베이스(Referecne sequence 및 NCBI blast)와 비교하여 A형 간염바이러스로 확인되었을 경우 검출된 것으로 최종 확인한다.

제7. 4.27을 다음과 같이 신설한다.

4.27 식품용수 등의 E형 간염바이러스

가. 시약 및 시액

1) 2% 티오황산나트륨(Sodium thiosulfate: Na2S2O3) 용액

4,800 mL의 증류수에 티오황산나트륨 100 g을 녹여 최종 5,000 mL의 용액을 제조하고 121℃, 15분간 고압증기 멸균한다.

2) 1M 염산(HCl) 용액

1M 염산(HCl) 용액은 식품용수 채수 시 검체의 pH를 조정하는데 사용한다.

3) 1.5% Beef extract(desiccated powder) 용액

1,900 mL의 증류수에 Beef extract 분말 30 g과 glycine 7.5 g(최종농도 = 0.05 M)을 넣고 1M NaOH를 이용하여 pH 9.5로 조정한 후 최종 2 L로 제조하고 121℃, 15분간 고압증기 멸균한다. Beef extract 용액은 4℃에서 일주일간 혹은 -20℃에서 장기간동안 보관할 수 있다.

4) 0.15 M 인산일수소나트륨, 7수화물(Sodium phosphate, dibasic, (Na2HPO4  7H2O)) 용액

950 mL의 증류수에 Sodium phosphate 40.2 g을 넣고 1M  NaOH를 이용하여 pH 9.5로 조정한 후 최종 1 L로 제조하고 121℃, 15분간 고압증기 멸균한다.

5) 1M 수산화나트륨(NaOH) 용액

400 mL의 증류수에 20 g의 수산화나트륨을 넣고 최종 500 mL로 제조하여 수산화나트륨 용액을 준비한다. 수산화나트륨 용액은 상온에서 수개월 동안 보관할 수 있다.

6) 바이러스 유전자 추출 키트(Viral RNA Mini Kits)

시판되는 바이러스 RNA 추출 키트(kit)를 사용한다.

※ 재현성 및 검출효율 등을 고려하여 QIAGEN-Viral RNA Mini Kits 또는 동등 이상의 제품사용 가능

나. 장치 및 기구

1) 검체 채수과정

가) 표준필터장치：식품용수 1,500∼1,800 L을 채수하는 장치

구성 : 용수 유입구, 단일주입기, 유량조절밸브, 압력게이지, 탈리액 주입구, 양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter), 카트리지 하우징(cartridge housing), 탈리액 유출구, 유량계, 용수 유출구

※ 양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter) : 1-MDS, NanoCeram 또는 이와 동등한 것

나) 휴대용 pH 측정기：식품용수의 수소이온농도를 측정한다.

다) 휴대용 탁도 측정기：식품용수의 혼탁도를 측정한다.

라) 휴대용 염소 농도 측정기：식품용수의 잔류염소농도를 측정한다.

마) 휴대용 아이스박스：식품용수 채수 후 양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter)를 운반하기 위해 사용한다.

바) 상업용 얼음팩：양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter) 운반 시 냉장상태 유지용으로 사용한다.

사) 기타：공구상자, 2 L 멸균 비커, 멸균된 알루미늄박, 클램프, 바이러스시료 검체기록부, 멸균장갑, 수은온도계, 멸균 메스실린더, 채수용 호스

ⓐ 용수 유입구 ⓑ 단일주입기 ⓒ 유량조절밸브 ⓓ 압력게이지 ⓔ 탈리액 주입구 ⓕ 감압단추 ⓖ 양전하 카트리지 필터 ⓗ 카트리지 하우징 ⓘ 탈리액 유출구 ⓙ 유량계 ⓚ 용수 유출구

《표준필터장치》

2) 바이러스 탈리과정

가) 연동정량펌프：1.5% 양전하 카트리지 필터로 유입시켜 흡착된 바이러스를 탈리하기 위한 장치

나) 연동정량펌프 탈리액 유입용 호스, 탈리액 유출용 호스

다) 자석교반기 및 자석교반 막대

라) 하우징 거치대, 탈리액 유입구, 탈리액 유출구, 압력게이지

3) 바이러스 농축과정

가) 원심분리기(4℃, 2,500∼10,000 G)

나) 원심분리용기(50∼500 mL 용량)

다) 0.22 μm 주사기 필터(30 mL 용량)

다. 시험방법

1) 식품용수 채수

채수할 때는 멸균된 장갑을 착용하여 바이러스가 오염되지 않게 주의하고 오염이 될 수 있는 환경요인들을 피하여야 한다. 멸균된 장갑이 사람의 피부나 오염 가능성이 있는 장치, 부품에 접촉이 되었을 경우 장갑을 바꿔 착용한다(예: 수도꼭지나 다른 환경요소 표면).

가) 채수하려는 검체의 배출구(수도꼭지 등)를 2～3분 정도 열고 식품용수를 흘려보낸다. 배출구에 채수호스를 장착 시 누수가 되지 않도록 클램프를 이용하여 단단히 연결하고 탁도가 균일할 때까지 흘려보낸 후 배출구를 잠근다.

나) 염소계소독제(예, HOCl 등)나 불꽃버너를 이용하여 배출구(수도꼭지 등)를 살균 또는 가열한다.

다) 채수용 호스의 알루미늄박을 제거한 후 채수 할 배출구에 연결하고 표준필터장치 용수 유입구(ⓐ)에 호스를 연결한다. 이 단계에서 양전하 카트리지 필터(ⓖ)는 연결하지 않는다.

라) 천천히 배출구를 열어 압력게이지가 200 kPa(30 PSI)가 넘지 않도록 배출구를 조절하고 76 L(20 gal)의 식품용수를 흘려보낸다.

마) 식품용수 76 L를 흘려 보낸 후 일부를 2 L 멸균 비커에 받아 용수의 탁도, pH, 온도, 염소농도를 각 각 측정하여 검체번호, 채수위치, 채수자의 이름과 함께 바이러스 검체채수기록부에 기록한다. pH 측정기는 사용 전 보정(calibration) 한다.

바) 용수 배출구(수도꼭지 등)를 잠그고 검체가 다음의 조건에 해당되어 부가장치의 연결이 필요한지의 여부를 결정하여 연결한다.

(1) pH 8이상일 경우 멸균된 튜브로 단일주입기(ⓑ)와 1 M 염산 용액이 담긴 메스실린더를 연결하고, 배출구(수도꼭지 등)를 다시 열어 용수의 pH가 6.5～7.5가 되도록 단일 주입기를 통해 1 M 염산 용액을 흘려보낸다. 용수유출구(ⓚ)로 흘러나온 용수의 pH를 측정해 바이러스 검체 채수기록부에 기록한다.

(2) 잔류염소 제거를 위해 위와 같이 단일주입기를 연결하여 식품용수 3.8 L(1 gal) 당 2% 티오황산나트륨 용액 10 mL이 주입되도록 한다.

* (1)과 (2)번이 모두 해당할 경우 이중주입기를 연결하여 사용한다.

사) 바이러스검체 채수기록부에 검체 채취일, 시작 시간, 유량계의 초기 수치를 기록한다.

아) 알루미늄박을 제거한 양전하 카트리지 필터를 탈리액 주입구(ⓔ)와 유출구(ⓘ) 사이에 연결한다.

자) 용수를 천천히 흐르게 하면서 카트리지 하우징 상단의 감압단추(ⓕ, vent button)를 눌러 내부공기가 완전히 빠지도록 한 후, 수도꼭지를 완전히 열어 준다.

차) 압력게이지가 200 kPa(30 PSI) 이하로 유지되도록 유량조절 밸브를 조정하고 식품용수 1,500～1,800 L를 통과시킨 후, 용수 배출구(수도꼭지 등)를 잠근다.

카) 바이러스 검체 채수기록부에 검체채취 종료일, 종료 시간, 유량계의 최종 수치 등을 기록한다.

타) 표준필터장치로부터 카트리지 하우징(ⓗ)을 분리하고 양전하 카트리지 필터를 거꾸로 하여 남은 물을 버린 후 하우징 양끝의 연결된 개구부를 멸균된 알루미늄박으로 싼다.

파) 양전하 카트리지 필터를 아이스박스에 담고 얼음팩 등을 사용하여 냉장상태(냉동시켜서는 아니 된다)로 유지하여 즉시 실험실로 운반한다.

2) 바이러스 탈리과정

가) 냉장 보관하여 운반한 필터는 채수 시작 시간부터 24시간 내에 실험실에서 바이러스 탈리 시험을 실시하여야 한다. 다만, 부득이한 경우로 인해 24시간 내에 탈리시험이 불가할 경우 최대 72시간이 넘지 않도록 한다.

나) 탈리용 거치대에 카트리지 하우징을 장착한 후 유량조절 밸브를 모두 닫는다.

다) 탈리액 주입구에 연동정량펌프 호스를 연결한 후 연동정량펌프와 1.5% Beef extract 용액이 채워져 있는 유리병에 호스를 차례로 연결하되, 1-MDS 필터는 1 L, NanoCeram 필터에는 0.5 L의 1.5% Beef extract 용액을 사용한다.

라) 탈리액 유출구에 유출용 호스를 연결하여 1.5% Beef extract 용액이 들어 있는 유리병에 넣고 탈리액 유출구를 닫는다.

마) 연동정량펌프를 가동하여 양전하 카트리지 필터 하우징 안으로 1.5% Beef extract 용액이 양전하 카트리지 필터 내에 완전히 차도록 한 후 감압단추를 통해 1.5% Beef extract 용액이 넘쳐 흘러나오기 시작하면 감압단추에서 손을 떼고, 연동정량펌프 가동을 멈춘 후 5분간 정치한다.

※ 감압단추는 탈리액이 양전하 카트리지 필터 안으로 가득 채워질 때까지 눌러준다.

바) 탈리액 유출구를 열고 연동정량펌프를 다시 가동한 후 하우징에 채워져 있는 1.5% Beef extract 용액이 서서히 필터를 통과하도록 한다. 통과한 완충액은 1.5% Beef extract 용액이 들어있던 유리병에 수집한다. 탈리액을 회수할 때는 거품이 없도록 주의하여야 한다.

※ 연동정량펌프 대신 양압펌프와 압력통을 사용하여 탈리과정을 진행할 수도 있다.

사) 유리병에 수집된 탈리액은 라)～바)의 과정을 2회 반복한다.

아) 최종 탈리액은 1 M 염산 용액으로 pH를 7.0～7.5 사이로 조절하고 멸균된 메스실린더를 사용하여 부피를 기록한다.

자) 탈리액은 24시간 이내에 농축시험이 가능할 경우 4℃에서 보관하며, 농축 시험을 즉시 시행하기 어려울 때에는 -70℃에서 보관한다.

3) 바이러스 농축과정

가) 최종 탈리액을 교반기에서 혼합하면서 1 M 염산용액으로 pH를 3.5±0.1로 조절한 후, 실온에서 30분간 천천히 섞는다.

나) 침전물이 생기면 탈리액을 멸균한 원심분리용기에 옮겨 원심분리한다(2,500 G 15분, 4℃).

다) 원심분리 후, 상등액을 제거하고 남은 침전물에 0.15 M sodium phosphate 완충액(pH 9.0～9.5)을  20～30 mL 넣어 완전히 부유 시킨 후 실온에 10분간 방치한다.

라) 부유시킨 용액을 원심분리한다(7,000 G, 10분, 4℃).

마) 상등액을 취해 1 M 염산용액으로 pH 7.0～7.5로 조절한다.

바) 미생물오염을 방지하기 위해 30 mL 주사기를 이용하여 상등액을 0.22 μm 주사기 필터로 여과한다. 검체 중의 바이러스가 필터에 흡착되는 것을 방지하기 위하여 사전에 0.22 μm 주사기 필터에 10～20 mL의 1.5% Beef extract 용액(pH 7.0～7.5)을 통과시킨다.

사) 최종 농축 검체량(FCSV=final concentrated sample volume)을 기록하고 검체를 24시간 이내에 분석할 경우는 4℃에 보관하고 나머지는 분석 전까지 -70℃에 보관한다.

아) 최종 농축검체 20～30 mL는 바이러스 유전자 추출을 위한 검체로 사용한다.

4) 바이러스 유전자 추출 과정

시판되는 바이러스 RNA 추출 키트(kit)를 사용하며, 제조사가 제시하는 적절한 실험법에 따라 실시한다.

※ 재현성 및 검출효율 등을 고려하여 QIAGEN-Viral RNA Mini Kits 또는 동등 이상의 제품이 사용이 가능하며, 또한 자동유전자 추출장치를 사용할 경우에도 바이러스 RNA 추출 키트를 사용하여 바이러스 유전자를 추출할 수 있다.

가) 바이러스 유전자 추출 시 검체와 동일한 과정으로 음성대조군(negative control)을 사용하여 유전자를 추출하며 검체의 경우 시험 진행 중 오염 여부를 확인하기 위해 2개의 RNA를 추출한다.

나) 검체 농축액과 음성대조군 각 280 μL에 AVL 완충액(guanidine thiocyanate 함유) 1,120 μL를 각각 혼합하여 실온에서 10분 동안 방치한 후 가볍게 원심분리기를 이용하여 원심분리(spin-down)한다.

다) 여기에 95～100% 에탄올 1,120 μL을 넣어 혼합한 후 가볍게 원심분리(spin-down)한다.

라) 혼합액 630 μL을 소량 원심(Mini spin) 컬럼으로 옮겨 6,000 G에서 1분간 원심분리하고 컬럼을 새로운 회수용(collection) 튜브로 옮긴 다음 남은 혼합액을 630 μL씩 동일한 방법으로 컬럼에 첨가하여 원심분리한다.

마) 소량 원심(Mini spin) 컬럼을 새로운 회수용(collection) 튜브로 옮겨 AW1 완충액(guanidine hydrochloride 함유) 500 μL을 넣고 6,000 G로 1분간 원심분리 후 컬럼을 새로운 회수용(collection) 튜브로 옮긴다.

바) AW2 완충액 500 μL을 넣고 20,000 G로 3분간 원심분리한 후 컬럼을 새로운 1.5 mL 회수용(collection) 튜브로 옮긴다.

사) AVE 완충액(sodium azide 함유) 60 μL를 넣고 6,000 G로 1분간 원심분리하여 다음의 RT-PCR(Reverse transcription-Polymerase chain reaction)을 수행하기 위한 주형(template)으로 사용한다.

5) E형 간염바이러스 유전자 PCR 과정 및 결과판정

RT-PCR(Reverse transcription-PCR)과정에서는 E형 간염바이러스를 인위적으로 조합하여 합성한 RNA 등을 PCR 양성대조군으로 사용할 수 있다.

가) One-step RT-PCR(Reverse transcription-PCR) 방법은 아래와 같이 수행한다.

(1) PCR 조성조건은 표 1과 같이 Mastermix(2X) 25 μL, Reverse transcriptase (50 unit/μL) 1 μL, 프라이머(3156N, 3157N)는  각 1 μL, 추출 RNA 5 μL를 첨가하여 증류수로 총 50 μL로 맞추고 반응시킨다.

(2) PCR 반응조건은 표 2와 같이 50℃에서 15분, 95℃에서 2분 DNA를 변성시키고, 95℃ 20초, 52℃ 30초, 72℃ 1분을 1회로 하여 35회 반응시킨 후, 72℃에서 5분간 연장 반응시킨다. 상기 반응 종료 후 PCR 생성물에 대하여 Nested PCR을 실시한다.

표 1. E형 간염바이러스 One-step RT-PCR(Reverse transcription-PCR) 반응액 조성

Component	Volume	Primer
Mastermix(2X)	25 μL	-
Reverse transcriptase(50unit/μL)	1 μL	-
D.W.	17 μL	-
Forward primer(20pmol)	1 μL	3156N
Reverse primer(20pmol)	1 μL	3157N
Extracted RNA, PCR control	5 μL	-
Total	50 μL	-

표 2. E형 간염바이러스 One-step RT-PCR(Reverse transcription-PCR) 반응조건 및 온도

	온도	시간	Cycle
cDNA 합성(cDNA synthesis) 초기 변성(predenaturation)	50℃ 95℃	15 min 2 min	1 cycle
변성(denaturation) 결합(annealing) 확장(extension)	95℃ 52℃ 72℃	20 sec 30 sec 1 min	35 cycles
최종신장(post-elongation)	72℃	5 min	1 cycle
보관	4℃	∞	∞

나) Nested PCR 방법은 아래와 같이 수행한다.

(1) One-step RT-PCR(Reverse transcription-PCR) 산물을 주형으로 하여 표 3과 같이 Nested PCR을 실시한다. 1차 PCR산물 2 μL, 10x 완충액(MgCl2 포함) 2 μL, dNTPs(10 mM) 2 μL, Taq DNA polymerase(1 unit/μL) 1 μL, 프라이머(3158N, 3159N)는 각 1 μL 첨가한 다음 최종 증류수로 총 20 μL로 맞춘 후 Nested PCR을 실시한다.

(2) PCR 반응조건은 표 4와 같이 94℃에서 5분간 DNA를 변성시키고 94℃ 30초, 52℃ 30초, 72℃ 30초를 1회로 하여 35회를 반응시킨 후 72℃에서 10분간 연장 반응시킨다.

표 3. E형 간염바이러스 Nested PCR 반응액 조성

Component	Volume	Primer
dNTPs(10mM)	2 μL	-
10x Buffer(with MgCl2)	2 μL	-
D.W.	11 μL	-
Forward primer(10 pmol)	1 μL	3158N
Reverse primer(10 pmol)	1 μL	3159N
Taq DNA polymerase(1 unit/μL)	1 μL	-
1st PCR Product	2 μL	-
Total	20 μL

표 4. E형 간염바이러스 Nested PCR 반응조건 및 온도

	온도	시간	cycle
초기 변성 (predenaturation)	94℃	5 min	1 cycle
변성(denaturation) 결합(annealing) 확장(extension)	94℃ 52℃ 72℃	30 sec 30 sec 30 sec	35 cycles
최종신장(post-elongation)	72℃	10 min	1 cycle
보관	4℃	∞	∞

(3) PCR 반응 종료 후 PCR 증폭 반응액 5 μL를 전기영동 완충액(gel loading buffer) 1 μL와 혼합한 다음 젤(gel)의 각 홈에 검체를 조심스럽게 넣고 나머지 한 홈에 PCR 증폭산물의 크기를 식별하기에 적당한 표식 DNA(marker DNA) 7 μL를 넣는다. 1.5% 아가로스 젤(agarose gel) 상에서 100V로 전기영동한 후 Ethidium Bromide(EtBr) 염색액(10 mg/mL)으로 30분간 염색한 후 증류수로 10분간 탈색하고 자외선 조사기(UV transilluminator)로 조사하여 증폭된 DNA 밴드를 관찰한다.

(4) E형 간염바이러스 유전자 증폭에 사용하는 프라이머는 표 5와 같다.

표 5. E형 간염바이러스 One-step RT-PCR 프라이머 염기서열

Primer	Sequence(5'→3')	Application	PCR Size(bp)
3156N	AAT TAT GCC CAG TAC CGG GTT G	One-step RT-PCR	731
3157N	CCC TTA TCC TGC TGA GCA TTC TC
3158N	GTT ATG CTT TGC ATA CAT GGC T	Nested PCR/ Sequencing	348
3159N	AGC CGA CGA AAT CAA TTC TGT C

다) 1차 결과 확인

(1) 아가로즈 젤(agarose gel)상에서 시료에 증폭산물이 348 bp 경우 E형 간염 바이러스로 일차 확인한다.

(2) 만일 음성대조군(negative control)에서 PCR 밴드가 확이 될 경우 등은 재시험을 실시해야한다(표 6 참고).

(3) E형 간염바이러스가 일차 확인된 경우 최종 확인을 위하여 아가로스 젤(agarose gel)상에서 해당부위를 절취하여 PCR 산물을 정제한 후 염기서열(DNA sequencing)을 분석하여 최종 판정한다.

표 6. E형 간염바이러스 PCR 결과판정(예시)

	추출 RNA(시료)	음성대조군	1차 판정
1	+	-	PCR 검출
	+
2	+	-	PCR 검출
	-
3	+	+	재 실험
	+
4	-	-	PCR 불검출
	-

+ : E형 간염바이러스 PCR 밴드 확인됨, - : 밴드가 확인되지 않음

라) 최종 검출 판정

(1) 염기서열 분석(DNA sequencing)을 위하여 다)의 (3)에서 정제된 DNA 1 μL를 주형으로 3158N과 3159N 프라이머를 사용한다.

(2) 염기서열 분석(sequencing) 반응을 위한 혼합 조건은 각 유전자형 Nested 프라이머(primer, 1 pmol)를 독립된 각각의 튜브에 2 μL, dye-terminator 2 μL, 정제 DNA 2 μL를 첨가하여 증류수로 최종 10 μL가 되도록 하고 96℃에서 1분간 DNA를 변성시킨 후, 96℃에서 10초간, 50℃에서 5초간, 60℃에서 4분간을 1회로 하여 25회 반응시킨 다음 60℃에서 10분간 연장반응을 시킨다.

(3) PCR 산물은 염기서열 분석(DNA sequencing)하되 2종 이상의 유전자가 혼합되어 있는 경우에는 클로닝 염기서열 분석(Cloning DNA sequencing)을 재실시 한다. 염기서열 분석(DNA sequencing)에 의해 결정된 염기서열은 E형 간염바이러스 유전자 데이터베이스(Referecne sequence 및 NCBI blast)와 비교하여 E형 간염바이러스로 확인되었을 경우 검출된 것으로 최종 확인한다.

제7. 4.28을 다음과 같이 신설한다.

4.28 식품용수 등의 로타바이러스

가. 시약 및 시액

1) 2% 티오황산나트륨(Sodium thiosulfate: Na2S2O3) 용액

4,800 mL의 증류수에 티오황산나트륨 100 g을 녹여 최종 5,000 mL의 용액을 제조하고 121℃, 15분간 고압증기 멸균한다.

2) 1M 염산(HCl) 용액

1M 염산(HCl) 용액은 식품용수 채수 시 검체의 pH를 조정하는데 사용한다.

3) 1.5% Beef extract(desiccated powder) 용액

1,900 mL의 증류수에 Beef extract 분말 30 g과 glycine 7.5 g(최종농도 = 0.05 M)을 넣고 1M NaOH를 이용하여 pH 9.5로 조정한 후 최종 2 L로 제조하고 121℃, 15분간 고압증기 멸균한다. Beef extract 용액은 4℃에서 일주일간 혹은 -20℃에서 장기간동안 보관할 수 있다.

4) 0.15 M 인산일수소나트륨, 7수화물(Sodium phosphate, dibasic, (Na2HPO4  7H2O)) 용액

950 mL의 증류수에 Sodium phosphate 40.2 g을 넣고 1M  NaOH를 이용하여 pH 9.5로 조정한 후 최종 1 L로 제조하고 121℃, 15분간 고압증기 멸균한다.

5) 1M 수산화나트륨(NaOH) 용액

400 mL의 증류수에 20 g의 수산화나트륨을 넣고 최종 500 mL로 제조하여 수산화나트륨 용액을 준비한다. 수산화나트륨 용액은 상온에서 수개월 동안 보관할 수 있다.

6) 바이러스 유전자 추출 키트(Viral RNA Mini Kits)

시판되는 바이러스 RNA 추출 키트(kit)를 사용한다.

※ 재현성 및 검출효율 등을 고려하여 QIAGEN-Viral RNA Mini Kits 또는 동등 이상의 제품사용 가능

나. 장치 및 기구

1) 검체 채수과정

가) 표준필터장치 : 식품용수 1,500∼1,800 L을 채수하는 장치

구성 : 용수 유입구, 단일주입기, 유량조절밸브, 압력게이지, 탈리액 주입구, 양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter), 카트리지 하우징(cartridge housing), 탈리액 유출구, 유량계, 용수 유출구

※ 양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter) : 1-MDS, NanoCeram 또는 이와 동등한 것

나) 휴대용 pH 측정기：식품용수의 수소이온농도를 측정한다.

다) 휴대용 탁도 측정기：식품용수의 혼탁도를 측정한다.

라) 휴대용 염소 농도 측정기：식품용수의 잔류염소농도를 측정한다.

마) 휴대용 아이스박스：식품용수 채수 후 양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter)를 운반하기 위해 사용한다.

바) 상업용 얼음팩：양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter) 운반 시 냉장상태 유지용으로 사용한다.

사) 기타：공구상자, 2 L 멸균 비커, 멸균된 알루미늄박, 클램프, 바이러스시료 검체기록부, 멸균장갑, 수은온도계, 멸균 메스실린더, 채수용 호스

ⓐ 용수 유입구 ⓑ 단일주입기 ⓒ 유량조절밸브 ⓓ 압력게이지 ⓔ 탈리액 주입구 ⓕ 감압단추 ⓖ 양전하 카트리지 필터 ⓗ 카트리지 하우징 ⓘ 탈리액 유출구 ⓙ 유량계 ⓚ 용수 유출구

《표준필터장치》

2) 바이러스 탈리과정

가) 연동정량펌프：1.5% 양전하 카트리지 필터로 유입시켜 흡착된 바이러스를 탈리하기 위한 장치

나) 연동정량펌프 탈리액 유입용 호스, 탈리액 유출용 호스

다) 자석교반기 및 자석교반 막대

라) 하우징 거치대, 탈리액 유입구, 탈리액 유출구, 압력게이지

3) 바이러스 농축과정

가) 원심분리기(4 ℃, 2,500∼10,000 G)

나) 원심분리용기(50∼500 mL 용량)

다) 0.22 μm 주사기 필터(30 mL 용량)

다. 시험방법

1) 식품용수 채수

채수할 때는 멸균된 장갑을 착용하여 바이러스가 오염되지 않게 주의하고 오염이 될 수 있는 환경요인들을 피하여야 한다. 멸균된 장갑이 사람의 피부나 오염 가능성이 있는 장치, 부품에 접촉이 되었을 경우 장갑을 바꿔 착용한다(예：수도꼭지나 다른 환경요소 표면).

가) 채수하려는 검체의 배출구(수도꼭지 등)를 2～3분 정도 열고 식품용수를 흘려보낸다. 배출구에 채수호스를 장착 시 누수가 되지 않도록 클램프를 이용하여 단단히 연결하고 탁도가 균일할 때까지 흘려보낸 후 배출구를 잠근다.

나) 염소계소독제(예, HOCl 등)나 불꽃버너를 이용하여 배출구(수도꼭지 등)를 살균 또는 가열한다.

다) 채수용 호스의 알루미늄박을 제거한 후 채수 할 배출구에 연결하고 표준필터장치 용수 유입구(ⓐ)에 호스를 연결한다. 이 단계에서 양전하 카트리지 필터(ⓖ)는 연결하지 않는다.

라) 천천히 배출구를 열어 압력게이지가 200 kPa(30 PSI)가 넘지 않도록 배출구를 조절하고 76 L(20 gal)의 식품용수를 흘려보낸다.

마) 식품용수 76 L를 흘려 보낸 후 일부를 2 L 멸균 비커에 받아 용수의 탁도, pH, 온도, 염소농도를 각 각 측정하여 검체번호, 채수위치, 채수자의 이름과 함께 바이러스 검체채수기록부에 기록한다. pH 측정기는 사용 전 보정(calibration) 한다.

바) 용수 배출구(수도꼭지 등)를 잠그고 검체가 다음의 조건에 해당되어 부가장치의 연결이 필요한지의 여부를 결정하여 연결한다.

(1) pH 8이상일 경우 멸균된 튜브로 단일주입기(ⓑ)와 1 M 염산 용액이 담긴 메스실린더를 연결하고, 배출구(수도꼭지 등)를 다시 열어 용수의 pH가 6.5～7.5가 되도록 단일 주입기를 통해 1 M 염산 용액을 흘려보낸다. 용수유출구(ⓚ)로 흘러나온 용수의 pH를 측정해 바이러스 검체 채수기록부에 기록한다.

(2) 잔류염소 제거를 위해 위와 같이 단일주입기를 연결하여 식품용수 3.8 L(1 gal) 당 2% 티오황산나트륨 용액 10 mL이 주입되도록 한다.

* (1)과 (2)번이 모두 해당할 경우 이중주입기를 연결하여 사용한다.

사) 바이러스검체 채수기록부에 검체 채취일, 시작 시간, 유량계의 초기 수치를 기록한다.

아) 알루미늄박을 제거한 양전하 카트리지 필터를 탈리액 주입구(ⓔ)와 유출구(ⓘ) 사이에 연결한다.

자) 용수를 천천히 흐르게 하면서 카트리지 하우징 상단의 감압단추(ⓕ, vent button)를 눌러 내부공기가 완전히 빠지도록 한 후, 수도꼭지를 완전히 열어 준다.

차) 압력게이지가 200 kPa(30 PSI) 이하로 유지되도록 유량조절 밸브를 조정하고 식품용수 1,500～1,800 L를 통과시킨 후, 용수 배출구(수도꼭지 등)를 잠근다.

카) 바이러스 검체 채수기록부에 검체채취 종료일, 종료 시간, 유량계의 최종 수치 등을 기록한다.

타) 표준필터장치로부터 카트리지 하우징(ⓗ)을 분리하고 양전하 카트리지 필터를 거꾸로 하여 남은 물을 버린 후 하우징 양끝의 연결된 개구부를 멸균된 알루미늄박으로 싼다.

파) 양전하 카트리지 필터를 아이스박스에 담고 얼음팩 등을 사용하여 냉장상태(냉동시켜서는 아니 된다)로 유지하여 즉시 실험실로 운반한다.

2) 바이러스 탈리과정

가) 냉장 보관하여 운반한 필터는 채수 시작 시간부터 24시간 내에 실험실에서 바이러스 탈리 시험을 실시하여야 한다. 다만, 부득이한 경우로 인해 24시간 내에 탈리시험이 불가할 경우 최대 72시간이 넘지 않도록 한다.

나) 탈리용 거치대에 카트리지 하우징을 장착한 후 유량조절 밸브를 모두 닫는다.

다) 탈리액 주입구에 연동정량펌프 호스를 연결한 후 연동정량펌프와 1.5% Beef extract 용액이 채워져 있는 유리병에 호스를 차례로 연결하되, 1-MDS 필터는 1 L, NanoCeram 필터에는 0.5 L의 1.5% Beef extract 용액을 사용한다.

라) 탈리액 유출구에 유출용 호스를 연결하여 1.5% Beef extract 용액이 들어 있는 유리병에 넣고 탈리액 유출구를 닫는다.

마) 연동정량펌프를 가동하여 양전하 카트리지 필터 하우징 안으로 1.5% Beef extract 용액이 양전하 카트리지 필터 내에 완전히 차도록 한 후 감압단추를 통해 1.5% Beef extract 용액이 넘쳐 흘러나오기 시작하면 감압단추에서 손을 떼고, 연동정량펌프 가동을 멈춘 후 5분간 정치한다.

※ 감압단추는 탈리액이 양전하 카트리지 필터 안으로 가득 채워질 때까지 눌러준다.

바) 탈리액 유출구를 열고 연동정량펌프를 다시 가동한 후 하우징에 채워져 있는 1.5% Beef extract 용액이 서서히 필터를 통과하도록 한다. 통과한 완충액은 1.5% Beef extract 용액이 들어있던 유리병에 수집한다. 탈리액을 회수할 때는 거품이 없도록 주의하여야 한다.

※ 연동정량펌프 대신 양압펌프와 압력통을 사용하여 탈리과정을 진행할 수도 있다.

사) 유리병에 수집된 탈리액은 라)～바)의 과정을 2회 반복한다.

아) 최종 탈리액은 1 M 염산 용액으로 pH를 7.0～7.5 사이로 조절하고 멸균된 메스실린더를 사용하여 부피를 기록한다.

자) 탈리액은 24시간 이내에 농축시험이 가능할 경우 4℃에서 보관하며, 농축 시험을 즉시 시행하기 어려울 때에는 -70℃에서 보관한다.

3) 바이러스 농축과정

가) 최종 탈리액을 교반기에서 혼합하면서 1 M 염산용액으로 pH를 3.5±0.1로 조절한 후, 실온에서 30분간 천천히 섞는다.

나) 침전물이 생기면 탈리액을 멸균한 원심분리용기에 옮겨 원심분리한다(2,500 G 15분, 4℃).

다) 원심분리 후, 상등액을 제거하고 남은 침전물에 0.15 M sodium phosphate 완충액(pH 9.0～9.5)을  20～30 mL 넣어 완전히 부유 시킨 후 실온에 10분간 방치한다.

라) 부유시킨 용액을 원심분리한다(7,000 G, 10분, 4℃).

마) 상등액을 취해 1 M 염산용액으로 pH 7.0～7.5로 조절한다.

바) 미생물오염을 방지하기 위해 30 mL 주사기를 이용하여 상등액을 0.22 μm 주사기 필터로 여과한다. 검체 중의 바이러스가 필터에 흡착되는 것을 방지하기 위하여 사전에 0.22 μm 주사기 필터에 10～20 mL의 1.5% Beef extract 용액(pH 7.0～7.5)을 통과시킨다.

사) 최종 농축 검체량(FCSV=final concentrated sample volume)을 기록하고 검체를 24시간 이내에 분석할 경우는 4℃에 보관하고 나머지는 분석 전까지 -70℃에 보관한다.

아) 최종 농축검체 20～30 mL는 바이러스 유전자 추출을 위한 검체로 사용한다.

4) 바이러스 유전자 추출 과정

시판되는 바이러스 RNA 추출 키트(kit)를 사용하며, 제조사가 제시하는 적절한 실험법에 따라 실시한다.

※ 재현성 및 검출효율 등을 고려하여 QIAGEN-Viral RNA Mini Kits 또는 동등 이상의 제품이 사용이 가능하며, 또한 자동유전자 추출장치를 사용할 경우에도 바이러스 RNA 추출 키트를 사용하여 바이러스 유전자를 추출할 수 있다.

가) 바이러스 유전자 추출 시 검체와 동일한 과정으로 음성대조군(negative control)을 사용하여 유전자를 추출하며 검체의 경우 시험 진행 중 오염 여부를 확인하기 위해 2개의 RNA를 추출한다.

나) 검체 농축액과 음성대조군 각 280 μL에 AVL 완충액(guanidine thiocyanate 함유) 1,120 μL를 각각 혼합하여 실온에서 10분 동안 방치한 후 가볍게 원심분리기를 이용하여 원심분리(spin-down)한다.

다) 여기에 95～100% 에탄올 1,120 μL을 넣어 혼합한 후 가볍게 원심분리(spin-down)한다.

라) 혼합액 630 μL을 소량 원심(Mini spin) 컬럼으로 옮겨 6,000 G에서 1분간 원심분리하고 컬럼을 새로운 회수용(collection) 튜브로 옮긴 다음 남은 혼합액을 630 μL씩 동일한 방법으로 컬럼에 첨가하여 원심분리한다.

마) 소량 원심(Mini spin) 컬럼을 새로운 회수용(collection) 튜브로 옮겨 AW1 완충액(guanidine hydrochloride 함유) 500 μL을 넣고 6,000 G로 1분간 원심분리 후 컬럼을 새로운 회수용(collection) 튜브로 옮긴다.

바) AW2 완충액 500 μL을 넣고 20,000 G로 3분간 원심분리한 후 컬럼을 새로운 1.5 mL 회수용(collection) 튜브로 옮긴다.

사) AVE 완충액(sodium azide 함유) 60 μL를 넣고 6,000 G로 1분간 원심분리하여 다음의 RT-PCR(Reverse transcription-Polymerase chain reaction)을 수행하기 위한 주형(template)으로 사용한다.

5)  로타바이러스 유전자 PCR 과정 및 결과판정

로타바이러스 PCR을 위한 RNA는 95℃, 5분 동안 Pre-denaturation 한 후 4℃에서 5분간 방치하고 사용한다. RT-PCR(Reverse transcription-PCR)과정에서는 로타바이러스를 인위적으로 조합하여 합성한 RNA 등을 PCR 양성대조군으로 사용할 수 있다. 로타바이러스 PCR은 VP4와 VP7 유전자 두 부위를 개별적으로 각각 증폭한다.

가) VP4와  VP7 유전자 One-step RT-PCR(Reverse transcription-PCR) 방법은 아래와 같이 수행한다.

(1) PCR 조성조건은 표 1과 같이 One-step RT-PCR(Reverse transcription-PCR) Mastermix 13.5 μL, 프라이머(VP4 : VP4F-M(20 pmol), Con2(20 pmol), VP7 : Beg-9(20 pmol), End-9(20 pmol))은 각 1 μL, 추출 RNA 5 μL를 첨가하여 증류수로 총 25 μL로 맞추고 반응시킨다.

(2) VP4 PCR 반응조건은 표 2와 같이 42℃에서 40분 cDNA를 합성하고, 95℃ 15분 동안 초기 변성 후, 94℃ 1분, 50℃ 1분, 72℃ 1분을 1회로 하여 35회 반응시킨 후, 72℃에서 7분간 연장 반응시킨다. VP7 PCR 반응조건은 표 3과 같이 42℃에서 30분 cDNA를 합성하고, 95℃ 15분 동안 초기 변성 후, 94℃ 30초, 42℃ 30초, 72℃ 1분를 1회로 하여 35회 반응시킨 후, 72℃에서 7분간 연장 반응시킨다.

표 1. 로타바이러스 One-step RT-PCR(Reverse transcription-PCR) 반응액 조성 (VP4, VP7 개별)

Component	Volume	Primers
		VP4	VP7
2X One-step RT- PCR Mastermix	13.5 μL	-
D.W.	4.5 μL	-
Forward primer (20pmol)	1 μL	VP4F-M	Beg-9
Reverse primer (20pmol)	1 μL	Con2	End-9
Extracted RNA	5 μL	-
Total	25 μL	-

표 2.  로타바이러스 VP4 부분 One-step RT-PCR(Reverse transcription-PCR) 반응조건 및 온도

	온도	시간	Cycle
cDNA 합성(cDNA synthesis)	42℃	40 min	1 cycle
초기 변성(predenaturation)	95℃	15 min	1 cycle
변성(denaturation) 결합(annealing) 확장(extension)	94℃ 50℃ 72℃	1 min 1 min 1 min	35 cycles
최종신장(post-elongation)	72℃	7 min	1 cycle
보관	4℃	∞	∞

표 3.  로타바이러스 VP7 부분 One-step RT-PCR(Reverse transcription-PCR) 반응조건 및 온도

	온도	시간	Cycle
cDNA 합성(cDNA synthesis)	42℃	30 min	1 cycle
초기 변성(predenaturation)	95℃	15 min	1 cycle
변성(denaturation) 결합(annealing) 확장(extension)	94℃ 42℃ 72℃	30 sec 30 sec 1 min	35 cycles
최종신장(post-elongation)	72℃	7 min	1 cycle
보관	4℃	∞	∞

(3) 로타바이러스 VP4, VP7 One-step RT-PCR(Reverse transcription-PCR)에 사용하는 프라이머는 표 4와 같다.

표 4. 로타바이러스 One-step RT-PCR(Reverse transcription-PCR) 프라이머 염기서열

Target	Primer	Sequence(5'→3')
VP4	VP4F-M	TGG CTT CGC TCA TTT ATA GAC A
	Con2	ATT TCG GAC CAT TTA TAA CC
VP7	Beg-9	ATG TAT GGT ATT GAA TAT ACC AC
	End-9	AAC TTG CCA CCA TTT TTT CC

나) VP4, VP7 One-step RT-PCR(Reverse transcription-PCR) 산물을 주형으로 하여 Multiplex PCR을 각각 실시한다.

(1) VP4 PCR 조성조건은 표 5와 같이 1차 PCR산물 2 μL, PCR Premix 10 μL, 프라이머 VP4F-M 1 μL(20 pmol), 1T-1 1 μL(20 pmol), 2T-1 1 μL(20 pmol), 3T-1 1 μL(20 pmol), 4T-1 2 μL(20 pmol),  5T-1 1 μL(20 pmol), P[11] 1 μL(20 pmol)  증류수로 총 25 μL로 맞춘 후 Multiplex PCR을 실시한다.  PCR 반응조건은 표 6과 같이 95℃에서 5분간 DNA를 변성시키고 94℃ 30초, 42℃ 30초, 72℃ 30초를 1회로 하여 25회를 반응시킨 후 72℃에서 7분간 연장 반응시킨다.

(2) VP7 PCR 조성조건은 표 7과 같이 1차 PCR산물 2 μL, PCR Premix 10 μL, 프라이머 End-9 1 μL(20 pmol), aBT1 1 μL(20 pmol), aCT2 1 μL(20 pmol), aET3 1 μL(20 pmol),  aDT4 1 μL(20 pmol), aAT8 1 μL(20 pmol), aFT9 1 μL(20 pmol), G10 1 μL(20 pmol) 증류수로 총 25 μL로 맞춘 후 Multiplex PCR을 실시한다. PCR 반응조건은 표 8과 같이 94℃에서 2분간 DNA를 변성시키고 94℃ 1분, 48℃ 2분, 68℃ 1분을 1회로 하여 30회를 반응시킨 후 68℃에서 7분간 연장 반응시킨다.

표 5. 로타바이러스 VP4 Multiplex PCR 반응액 조성

Component	Volume	Primer	Genotype
PCR Premix	10 μL	-	-
D.W.	6 μL	-	-
Forward primer(20pmol)	각 1 μL	1T-1 2T-1 3T-1 4T-1 5T-1 P[11]	P1A[8] P1B[4] P2A[6] P3[9] P4[10] P[11]
Reverse primer(20pmol)	1 μL	VP4F-M	-
1st PCR Product	2 μL	-	-
Total	25 μL	-	-

표 6. 로타바이러스 VP4 Multiplex PCR 반응조건 및 온도

	온도	시간	Cycle
초기 변성(predenaturation)	95℃	5 min	1 cycle
변성(denaturation) 결합(annealing) 확장(extension)	94℃ 42℃ 72℃	30 sec 30 sec 30 sec	25 cycles
최종신장(post-elongation)	72℃	7 min	1 cycle
보관	4℃	∞	∞

표 7. 로타바이러스 VP7 Multiplex PCR 반응액 조성

Component	Volume	Primer	Genotype
PCR Premix	10 μL	-	-
D.W.	5 μL	-	-
Forward primer(20pmol)	각 1 μL	aBT1 aCT2 aET3 aDT4 aAT8 aFT9 G10	G1 G2 G4 G4 G8 G9 G10
Reverse primer(10pmol)	1 μL	End-9(R)	-
1st PCR Product	2 μL	-	-
Total	25 μL	-	-

표 8. 로타바이러스 VP7 Multiplex PCR 반응조건 및 온도

	온도	시간	Cycle
초기 변성(predenaturation)	94℃	2 min	1 cycle
변성(denaturation) 결합(annealing) 확장(extension)	94℃ 48℃ 68℃	1 min 2 min 1 min	30 cycles
최종신장(post-elongation)	68℃	7 min	1 cycle
보관	4℃	∞	∞

(3) 로타바이러스 VP4, VP7 Multiplex PCR에 사용하는 프라이머는 표 9와 같다.

표 9. 로타바이러스 VP4, VP7 Multiplex PCR 프라이머 염기서열

Target	Primer	Sequence(5'→3')
VP4	VP4F-M(F)	TGG CTT CGC TCA TTT ATA GAC A
	1T-1(R)	TCT ACT GGR TTR ACN TGC
	2T-1(R)	CTA TTG TTA GAG GTT AGA GTC
	3T-1(R)	TGT TGA TTA GTT GGA TTC AA
	4T-1(R)	TGA GAC ATG CAA TTG GAC
	5T-1(R)	ATC ATA GTT AGT AGT CGG
	P[11](R)	GTA AAC ATC CAG AAT GTG
VP7	End-9(R)	AAC TTG CCA CCA TTT TTT CC
	aBT1(F)	CAA GTA CTC AAA TCA ATG ATG G
	aCT2(F)	CAA TGA TAT TAA CAC ATT TTC TGT G
	aET3(F)	ACG AAC TCA ACA CGA GAG G
	aDT4(F)	CGT TTC TGG TGA GGA GTT G
	aAT8(F)	GTC ACA CCA TTT GTA AAT TCG
	aFT9(F)	CTT GAT GTG ACT AYA AAT AC
	G10(F)	ATG TCA GAC TAC ARA TAC TGG

(4) PCR 반응 종료 후 PCR 증폭 반응액 5 μL를 전기영동 완충액(gel loading buffer) 1 μL와 혼합한 다음 젤(gel)의 각 홈에 검체를 조심스럽게 넣고 나머지 한 홈에 PCR 증폭산물의 크기를 식별하기에 적당한 표식 DNA(marker DNA) 7 μL를 넣는다. 1.5% 아가로스 젤(agarose gel) 상에서 100V로 전기영동한 후 Ethidium Bromide(EtBr) 염색액(10 mg/mL)으로 30분간 염색한 후 증류수로 10분간 탈색하고 자외선 조사기(UV transilluminator)로 조사하여 증폭된 DNA 밴드를 관찰한다.

다) 1차 결과 확인

(1) VP4, VP7 PCR 증폭 반응액을 전기영동하여 표 10과 비교하여 PCR 증폭산물의 크기가 확인되면 로타바이러스로 일차 확인한다.

표 10.  VP4, VP7 PCR 증폭 크기

VP4
P-genotype	Primer	PCR 산물크기(bp)
P1A[8]	1T-1	345
P1B[4]	2T-2	483
P2A[6]	3T-1	267
P3[9]	4T-1	391
P4[10]	5T-1	583
P[11]	P[11]	312

VP7
G-genotype	Primer	PCR 산물크기(bp)
G1	aBT1	618
G2	aCT2	521
G3	aET3	682
G4	aDT4	452
G8	aAT8	754
G9	aFT9	179
G10	G10	266

(2) 만일 음성대조군(negative control)에서 PCR 밴드가 확인 될 경우 등은 재시험을 실시해야한다(표 11 참고).

(3) 로타바이러스가 일차 확인된 경우 최종 확인을 위하여 아가로스 젤(agarose gel)상에서 해당부위를 절취하여 PCR 산물을 정제한 후 염기서열(DNA sequencing)을 분석하여 최종 판정한다.

표 11. 로타바이러스 PCR 결과판정(예시)

	추출 RNA(시료)	음성대조군	1차 판정
1	+	-	PCR 검출
	+
2	+	-	PCR 검출
	-
3	+	+	재 실험
	+
4	-	-	PCR 불검출
	-

+ : 로타바이러스 PCR 밴드 확인됨, - : 밴드가 확인되지 않음

라) 최종 검출 판정

(1) 염기서열 분석(DNA sequencing)을 위하여 다)의 (3)에서 정제된 DNA 1 μL를 주형으로 VP4이나 VP7 Multiplex PCR 증폭에 사용한 프라이머를 사용한다.

(2) 염기서열 분석(sequencing) 반응을 위한 혼합 조건은 각 유전자형 Multiplex 프라이머(primer, 1 pmol)를 독립된 각각의 튜브에 2 μL, dye-terminator 2 μL, 정제 DNA 2 μL를 첨가하여 증류수로 최종 10 μL가 되도록 하고 96℃에서 1분간 DNA를 변성시킨 후, 96℃에서 10초간, 50℃에서 5초간, 60℃에서 4분간을 1회로 하여 25회 반응시킨 다음 60℃에서 10분간 연장반응을 시킨다.

(3) PCR 산물은 염기서열 분석(DNA sequencing)하되 2종 이상의 유전자가 혼합되어 있는 경우에는 클로닝 염기서열 분석(Cloning DNA sequencing)을 재실시 한다. 염기서열 분석(DNA sequencing)에 의해 결정된 염기서열은 로타바이러스 유전자 데이터베이스(Referecne sequence 및 NCBI blast)와 비교하여 로타바이러스로 확인되었을 경우 검출된 것으로 최종 확인한다.

제7. 4.29를 다음과 같이 신설한다.

4.29 식품용수 등의 아스트로바이러스

가. 시약 및 시액

1) 2% 티오황산나트륨(Sodium thiosulfate: Na2S2O3) 용액

4,800 mL의 증류수에 티오황산나트륨 100 g을 녹여 최종 5,000 mL의 용액을 제조하고 121℃, 15분간 고압증기 멸균한다.

2) 1M 염산(HCl) 용액

1M 염산(HCl) 용액은 식품용수 채수 시 검체의 pH를 조정하는데 사용한다.

3) 1.5% Beef extract(desiccated powder) 용액

1,900 mL의 증류수에 Beef extract 분말 30 g과 glycine 7.5 g(최종농도 = 0.05 M)을 넣고 1M NaOH를 이용하여 pH 9.5로 조정한 후 최종 2 L로 제조하고 121℃, 15분간 고압증기 멸균한다. Beef extract 용액은 4℃에서 일주일간 혹은 -20℃에서 장기간동안 보관할 수 있다.

4) 0.15 M 인산일수소나트륨, 7수화물(Sodium phosphate, dibasic, (Na2HPO4  7H2O)) 용액

950 mL의 증류수에 Sodium phosphate 40.2 g을 넣고 1M NaOH를 이용하여 pH 9.5로 조정한 후 최종 1 L로 제조하고 121℃, 15분간 고압증기 멸균한다.

5) 1M 수산화나트륨(NaOH) 용액

400 mL의 증류수에 20 g의 수산화나트륨을 넣고 최종 500 mL로 제조하여 수산화나트륨 용액을 준비한다. 수산화나트륨 용액은 상온에서 수개월 동안 보관할 수 있다.

6) 바이러스 유전자 추출 키트(Viral RNA Mini Kits)

시판되는 바이러스 RNA 추출 키트(kit)를 사용한다.

※ 재현성 및 검출효율 등을 고려하여 QIAGEN-Viral RNA Mini Kits 또는 동등 이상의 제품사용 가능

나. 장치 및 기구

1) 검체 채수과정

가) 표준필터장치：식품용수 1,500∼1,800 L을 채수하는 장치

구성 : 용수 유입구, 단일주입기, 유량조절밸브, 압력게이지, 탈리액 주입구, 양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter), 카트리지 하우징(cartridge housing), 탈리액 유출구, 유량계, 용수 유출구

※ 양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter) : 1-MDS, NanoCeram 또는 이와 동등한 것

나) 휴대용 pH 측정기：식품용수의 수소이온농도를 측정한다.

다) 휴대용 탁도 측정기：식품용수의 혼탁도를 측정한다.

라) 휴대용 염소 농도 측정기：식품용수의 잔류염소농도를 측정한다.

마) 휴대용 아이스박스：식품용수 채수 후 양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter)를 운반하기 위해 사용한다.

바) 상업용 얼음팩：양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter) 운반 시 냉장상태 유지용으로 사용한다.

사) 기타：공구상자, 2 L 멸균 비커, 멸균된 알루미늄박, 클램프, 바이러스시료 검체기록부, 멸균장갑, 수은온도계, 멸균 메스실린더, 채수용 호스

ⓐ 용수 유입구 ⓑ 단일주입기 ⓒ 유량조절밸브 ⓓ 압력게이지 ⓔ 탈리액 주입구 ⓕ 감압단추 ⓖ 양전하 카트리지 필터 ⓗ 카트리지 하우징 ⓘ 탈리액 유출구 ⓙ 유량계 ⓚ 용수 유출구

《표준필터장치》

2) 바이러스 탈리과정

가) 연동정량펌프：1.5% 양전하 카트리지 필터로 유입시켜 흡착된 바이러스를 탈리하기 위한 장치

나) 연동정량펌프 탈리액 유입용 호스, 탈리액 유출용 호스

다) 자석교반기 및 자석교반 막대

라) 하우징 거치대, 탈리액 유입구, 탈리액 유출구, 압력게이지

3) 바이러스 농축과정

가) 원심분리기(4 ℃, 2,500∼10,000 G)

나) 원심분리용기(50∼500 mL 용량)

다) 0.22 μm 주사기 필터(30 mL 용량)

다. 시험방법

1) 식품용수 채수

채수할 때는 멸균된 장갑을 착용하여 바이러스가 오염되지 않게 주의하고 오염이 될 수 있는 환경요인들을 피하여야 한다. 멸균된 장갑이 사람의 피부나 오염 가능성이 있는 장치, 부품에 접촉이 되었을 경우 장갑을 바꿔 착용한다(예：수도꼭지나 다른 환경요소 표면).

가) 채수하려는 검체의 배출구(수도꼭지 등)를 2～3분 정도 열고 식품용수를 흘려보낸다. 배출구에 채수호스를 장착 시 누수가 되지 않도록 클램프를 이용하여 단단히 연결하고 탁도가 균일할 때까지 흘려보낸 후 배출구를 잠근다.

나) 염소계소독제(예, HOCl 등)나 불꽃버너를 이용하여 배출구(수도꼭지 등)를 살균 또는 가열한다.

다) 채수용 호스의 알루미늄박을 제거한 후 채수 할 배출구에 연결하고 표준필터장치 용수 유입구(ⓐ)에 호스를 연결한다. 이 단계에서 양전하 카트리지 필터(ⓖ)는 연결하지 않는다.

라) 천천히 배출구를 열어 압력게이지가 200 kPa(30 PSI)가 넘지 않도록 배출구를 조절하고 76 L(20 gal)의 식품용수를 흘려보낸다.

마) 식품용수 76 L를 흘려 보낸 후 일부를 2 L 멸균 비커에 받아 용수의 탁도, pH, 온도, 염소농도를 각 각 측정하여 검체번호, 채수위치, 채수자의 이름과 함께 바이러스 검체채수기록부에 기록한다. pH 측정기는 사용 전 보정(calibration) 한다.

바) 용수 배출구(수도꼭지 등)를 잠그고 검체가 다음의 조건에 해당되어 부가장치의 연결이 필요한지의 여부를 결정하여 연결한다.

(1) pH 8이상일 경우 멸균된 튜브로 단일주입기(ⓑ)와 1 M 염산 용액이 담긴 메스실린더를 연결하고, 배출구(수도꼭지 등)를 다시 열어 용수의 pH가 6.5～7.5가 되도록 단일 주입기를 통해 1 M 염산 용액을 흘려보낸다. 용수유출구(ⓚ)로 흘러나온 용수의 pH를 측정해 바이러스 검체 채수기록부에 기록한다.

(2) 잔류염소 제거를 위해 위와 같이 단일주입기를 연결하여 식품용수 3.8 L(1 gal) 당 2% 티오황산나트륨 용액 10 mL이 주입되도록 한다.

* (1)와 (2)번이 모두 해당할 경우 이중주입기를 연결하여 사용한다.

사) 바이러스검체 채수기록부에 검체 채취일, 시작 시간, 유량계의 초기 수치를 기록한다.

아) 알루미늄박을 제거한 양전하 카트리지 필터를 탈리액 주입구(ⓔ)와 유출구(ⓘ) 사이에 연결한다.

자) 용수를 천천히 흐르게 하면서 카트리지 하우징 상단의 감압단추(ⓕ, vent button)를 눌러 내부공기가 완전히 빠지도록 한 후, 수도꼭지를 완전히 열어 준다.

차) 압력게이지가 200 kPa(30 PSI) 이하로 유지되도록 유량조절 밸브를 조정하고 식품용수 1,500～1,800 L를 통과시킨 후, 용수 배출구(수도꼭지 등)를 잠근다.

카) 바이러스 검체 채수기록부에 검체채취 종료일, 종료 시간, 유량계의 최종 수치 등을 기록한다.

타) 표준필터장치로부터 카트리지 하우징(ⓗ)을 분리하고 양전하 카트리지 필터를 거꾸로 하여 남은 물을 버린 후 하우징 양끝의 연결된 개구부를 멸균된 알루미늄박으로 싼다.

파) 양전하 카트리지 필터를 아이스박스에 담고 얼음팩 등을 사용하여 냉장상태(냉동시켜서는 아니 된다)로 유지하여 즉시 실험실로 운반한다.

2) 바이러스 탈리과정

가) 냉장 보관하여 운반한 필터는 채수 시작 시간부터 24시간 내에 실험실에서 바이러스 탈리 시험을 실시하여야 한다. 다만, 부득이한 경우로 인해 24시간 내에 탈리시험이 불가할 경우 최대 72시간이 넘지 않도록 한다.

나) 탈리용 거치대에 카트리지 하우징을 장착한 후 유량조절 밸브를 모두 닫는다.

다) 탈리액 주입구에 연동정량펌프 호스를 연결한 후 연동정량펌프와 1.5% Beef extract 용액이 채워져 있는 유리병에 호스를 차례로 연결하되, 1-MDS 필터는 1 L, NanoCeram 필터에는 0.5 L의 1.5% Beef extract 용액을 사용한다.

라) 탈리액 유출구에 유출용 호스를 연결하여 1.5% Beef extract 용액이 들어 있는 유리병에 넣고 탈리액 유출구를 닫는다.

마) 연동정량펌프를 가동하여 양전하 카트리지 필터 하우징 안으로 1.5% Beef extract 용액이 양전하 카트리지 필터 내에 완전히 차도록 한 후 감압단추를 통해 1.5% Beef extract 용액이 넘쳐 흘러나오기 시작하면 감압단추에서 손을 떼고, 연동정량펌프 가동을 멈춘 후 5분간 정치한다.

※ 감압단추는 탈리액이 양전하 카트리지 필터 안으로 가득 채워질 때까지 눌러준다.

바) 탈리액 유출구를 열고 연동정량펌프를 다시 가동한 후 하우징에 채워져 있는 1.5% Beef extract 용액이 서서히 필터를 통과하도록 한다. 통과한 완충액은 1.5% Beef extract 용액이 들어있던 유리병에 수집한다. 탈리액을 회수할 때는 거품이 없도록 주의하여야 한다.

※ 연동정량펌프 대신 양압펌프와 압력통을 사용하여 탈리과정을 진행할 수도 있다.

사) 유리병에 수집된 탈리액은 라)～바)의 과정을 2회 반복한다.

아) 최종 탈리액은 1 M 염산 용액으로 pH를 7.0～7.5 사이로 조절하고 멸균된 메스실린더를 사용하여 부피를 기록한다.

자) 탈리액은 24시간 이내에 농축시험이 가능할 경우 4℃에서 보관하며, 농축 시험을 즉시 시행하기 어려울 때에는 -70℃에서 보관한다.

3) 바이러스 농축과정

가) 최종 탈리액을 교반기에서 혼합하면서 1 M 염산용액으로 pH를 3.5±0.1로 조절한 후, 실온에서 30분간 천천히 섞는다.

나) 침전물이 생기면 탈리액을 멸균한 원심분리용기에 옮겨 원심분리한다(2,500 G 15분, 4℃).

다) 원심분리 후, 상등액을 제거하고 남은 침전물에 0.15 M sodium phosphate 완충액(pH 9.0～9.5)을  20～30 mL 넣어 완전히 부유 시킨 후 실온에 10분간 방치한다.

라) 부유시킨 용액을 원심분리한다(7,000 G, 10분, 4℃).

마) 상등액을 취해 1 M 염산용액으로 pH 7.0～7.5로 조절한다.

바) 미생물오염을 방지하기 위해 30 mL 주사기를 이용하여 상등액을 0.22 μm 주사기 필터로 여과한다. 검체 중의 바이러스가 필터에 흡착되는 것을 방지하기 위하여 사전에 0.22 μm 주사기 필터에 10～20 mL의 1.5% Beef extract 용액(pH 7.0～7.5)을 통과시킨다.

사) 최종 농축 검체량(FCSV=final concentrated sample volume)을 기록하고 검체를 24시간 이내에 분석할 경우는 4℃에 보관하고 나머지는 분석 전까지 -70℃에 보관한다.

아) 최종 농축검체 20～30 mL는 바이러스 유전자 추출을 위한 검체로 사용한다.

4) 바이러스 유전자 추출 과정

시판되는 바이러스 RNA 추출 키트(kit)를 사용하며, 제조사가 제시하는 적절한 실험법에 따라 실시한다.

※ 재현성 및 검출효율 등을 고려하여 QIAGEN-Viral RNA Mini Kits 또는 동등 이상의 제품이 사용이 가능하며, 또한 자동유전자 추출장치를 사용할 경우에도 바이러스 RNA 추출 키트를 사용하여 바이러스 유전자를 추출할 수 있다.

가) 바이러스 유전자 추출 시 검체와 동일한 과정으로 음성대조군(negative control)을 사용하여 유전자를 추출하며 검체의 경우 시험 진행 중 오염 여부를 확인하기 위해 2개의 RNA를 추출한다.

나) 검체 농축액과 음성대조군 각 280 μL에 AVL 완충액(guanidine thiocyanate 함유) 1,120 μL를 각각 혼합하여 실온에서 10분 동안 방치한 후 가볍게 원심분리기를 이용하여 원심분리(spin-down)한다.

다) 여기에 95～100% 에탄올 1,120 μL을 넣어 혼합한 후 가볍게 원심분리(spin-down)한다.

라) 혼합액 630 μL을 소량 원심(Mini spin) 컬럼으로 옮겨 6,000 G에서 1분간 원심분리하고 컬럼을 새로운 회수용(collection) 튜브로 옮긴 다음 남은 혼합액을 630 μL씩 동일한 방법으로 컬럼에 첨가하여 원심분리한다.

마) 소량 원심(Mini spin) 컬럼을 새로운 회수용(collection) 튜브로 옮겨 AW1 완충액(guanidine hydrochloride 함유) 500 μL을 넣고 6,000 G로 1분간 원심분리 후 컬럼을 새로운 회수용(collection) 튜브로 옮긴다.

바) AW2 완충액 500 μL을 넣고 20,000 G로 3분간 원심분리한 후 컬럼을 새로운 1.5 mL 회수용(collection) 튜브로 옮긴다.

사) AVE 완충액(sodium azide 함유) 60 μL를 넣고 6,000 G로 1분간 원심분리하여 다음의 RT-PCR(Reverse transcription-Polymerase chain reaction)을 수행하기 위한 주형(template)으로 사용한다.

5) 아스트로바이러스 유전자 PCR 과정 및 결과판정

RT-PCR(Reverse transcription-PCR)과정에서는 아스트로바이러스를 인위적으로 조합하여 합성한 RNA 등을 PCR 양성대조군으로 사용할 수 있다.

가) One-step RT-PCR(Reverse transcription-PCR) 방법은 아래와 같이 수행한다.

(1) PCR 조성조건은 Mastermix(2X) 12.5 μL, Reverse transcriptase (50unit/μL) 0.5 μL, 프라이머(Mon 269, Mon 270)는 각 2 μL, 추출 RNA 2 μL를 첨가하여 증류수로 총 25 μL로 맞추고 반응시킨다.

(2) PCR 반응조건은 48℃에서 40분, 94℃에서 3분 DNA를 변성시키고, 94℃ 30초, 52℃ 30초, 72℃ 1분 30초를 1회로 하여 35회 반응시킨 후, 68℃에서 5분간 연장 반응시킨다.

표 1. 아스트로바이러스 One-step RT-PCR(Reverse transcription-PCR) 반응액 조성

Component	Volume	Primer
Mastermix(2X)	12.5 μL	-
Reverse transcriptase (50unit/μL)	0.5 μL	-
D.W.	6 μL	-
Forward primer(10 pmol)	2 μL	Mon 269
Reverse primer(10 pmol)	2 μL	Mon 270
Extracted RNA	2 μL	-
Total	25 μL

표 2. 아스트로바이러스 One-step RT-PCR(Reverse transcription-PCR) 반응조건 및 온도

	온도	시간	cycle
cDNA 합성(cDNA synthesis) 초기 변성(predenaturation)	48℃ 94℃	40 min 3 min	1 cycle
변성(denaturation) 결합(annealing) 확장(extension)	94℃ 52℃ 72℃	30 sec 30 sec 1 min 30sec	35 cycles
최종신장(post-elongation)	68℃	5 min	1 cycle
보관	4℃	∞	∞

표 3. 아스트로바이러스 One-step RT-PCR(Reverse transcription-PCR)  프라이머 염기서열

primer	Sequence(5'→3')	Application	PCR Size(bp)
Mon 269	CAA CTC AGG AAA CAG GGT GT	One-step RT- PCR/Sequencing	449
Mon 270	TCA GAT GCA TTG TCA TTG GT

나) 1차 결과 확인

(1) 아가로스 젤(agarose gel)상에서 시료에 증폭산물이 449 bp 경우 아스트로바이러스로 일차 확인한다.

(2) 만일 음성대조군(negative control)에서 PCR 밴드가 확이 될 경우 등은 재시험을 실시해야한다(표 4 참고).

(3) 아스트로바이러스가 일차 확인된 경우 최종 확인을 위하여 아가로스 젤(agarose gel)상에서 해당부위를 절취하여 PCR 산물을 정제한 후 염기서열(DNA sequencing)을 분석하여 최종 판정한다.

표 4. 아스트로바이러스 PCR 결과판정(예시)

	추출 RNA(시료)	음성대조군	1차 판정
1	+	-	PCR 검출
	+
2	+	-	PCR 검출
	-
3	+	+	재 실험
	+
4	-	-	PCR 불검출
	-

+ : 아스트로바이러스 PCR 밴드 확인됨, - : 밴드가 확인되지 않음

다) 최종 검출 판정

(1) 염기서열 분석(DNA sequencing)을 위하여 다)의 (3)에서 정제된 DNA 1 μL를 주형으로 바이러스 유전형 및 진행방향에 따라 Mon 269 및 Mon 270의 프라이머를 사용한다.

(2) 염기서열 분석(sequencing) 반응을 위한 혼합 조건은 각 프라이머(primer, 1 pmol)를 독립된 각각의 튜브에 2 μL, dye-terminator 2 μL, 정제 DNA 2 μL를 첨가하여 증류수로 최종 10 μL가 되도록 하고 96℃에서 1분간 DNA를 변성시킨 후, 96℃에서 10초간, 50℃에서 5초간, 60℃에서 4분간을 1회로 하여 25회 반응시킨 다음 60℃에서 10분간 연장반응을 시킨다.

(3) PCR 산물은 염기서열 분석(DNA sequencing)하되 2종 이상의 유전자가 혼합되어 있는 경우에는 클로닝 염기서열 분석(Cloning DNA sequencing)을 재실시 한다. 염기서열 분석(DNA sequencing)에 의해 결정된 염기서열은 아스트로바이러스 유전자 데이터베이스(Referecne sequence 및 NCBI blast)와 비교하여 아스트로바이러스로 확인되었을 경우 검출된 것으로 최종 확인한다.

제7. 4.30을 다음과 같이 신설한다.

4.30 식품용수 등의 장관아데노바이러스

가. 시약 및 시액

1) 2% 티오황산나트륨(Sodium thiosulfate: Na2S2O3) 용액

4,800 mL의 증류수에 티오황산나트륨 100 g을 녹여 최종 5,000 mL의 용액을 제조하고 121℃, 15분간 고압증기 멸균한다.

2) 1M 염산(HCl) 용액

1M 염산(HCl) 용액은 식품용수 채수 시 검체의 pH를 조정하는데 사용한다.

3) 1.5% Beef extract(desiccated powder) 용액

1,900 mL의 증류수에 Beef extract 분말 30 g과 glycine 7.5 g(최종농도 = 0.05 M)을 넣고 1M NaOH를 이용하여 pH 9.5로 조정한 후 최종 2 L로 제조하고 121℃, 15분간 고압증기 멸균한다. Beef extract 용액은 4℃에서 일주일간 혹은 -20℃에서 장기간동안 보관할 수 있다.

4) 0.15 M 인산일수소나트륨, 7수화물(Sodium phosphate, dibasic, (Na2HPO4  7H2O)) 용액

950 mL의 증류수에 Sodium phosphate  40.2 g을 넣고 1M  NaOH를 이용하여 pH 9.5로 조정한 후 최종 1 L로 제조하고 121℃, 15분간 고압증기 멸균한다.

5) 1M 수산화나트륨(NaOH) 용액

400 mL의 증류수에 20 g의 수산화나트륨을 넣고 최종 500 mL로 제조하여 수산화나트륨 용액을 준비한다. 수산화나트륨 용액은 상온에서 수개월 동안 보관할 수 있다.

6) 바이러스 유전자 추출 키트

시판되는 바이러스 DNA 추출 키트(kit)를 사용하며, 제조사가 제시하는 적절한 실험법에 따라 실시한다.

※ 또한 자동유전자 추출장치를 사용할 경우에도 바이러스 추출 키트를 사용하여 바이러스 유전자를 추출할 수 있다.

나. 장치 및 기구

1) 검체 채수과정

가) 표준필터장치：식품용수 1,500∼1,800 L을 채수하는 장치

구성 : 용수 유입구, 단일주입기, 유량조절밸브, 압력게이지, 탈리액 주입구, 양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter), 카트리지 하우징(cartridge housing), 탈리액 유출구, 유량계, 용수 유출구

※ 양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter) : 1-MDS, NanoCeram 또는 이와 동등한 것

나) 휴대용 pH 측정기：식품용수의 수소이온농도를 측정한다.

다) 휴대용 탁도 측정기：식품용수의 혼탁도를 측정한다.

라) 휴대용 염소 농도 측정기：식품용수의 잔류염소농도를 측정한다.

마) 휴대용 아이스박스：식품용수 채수 후 양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter)를 운반하기 위해 사용한다.

바) 상업용 얼음팩：양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter) 운반 시 냉장상태 유지용으로 사용한다.

사) 기타：공구상자, 2 L 멸균 비커, 멸균된 알루미늄박, 클램프, 바이러스시료 검체기록부, 멸균장갑, 수은온도계, 멸균 메스실린더, 채수용 호스

ⓐ 용수 유입구 ⓑ 단일주입기 ⓒ 유량조절밸브 ⓓ 압력게이지 ⓔ 탈리액 주입구 ⓕ 감압단추 ⓖ 양전하 카트리지 필터 ⓗ 카트리지 하우징 ⓘ 탈리액 유출구 ⓙ 유량계 ⓚ 용수 유출구

《표준필터장치》

2) 바이러스 탈리과정

가) 연동정량펌프：1.5% 양전하 카트리지 필터로 유입시켜 흡착된 바이러스를 탈리하기 위한 장치

나) 연동정량펌프 탈리액 유입용 호스, 탈리액 유출용 호스

다) 자석교반기 및 자석교반 막대

라) 하우징 거치대, 탈리액 유입구, 탈리액 유출구, 압력게이지

3) 바이러스 농축과정

가) 원심분리기(4 ℃, 2,500∼10,000 G)

나) 원심분리용기(50∼500 mL 용량)

다) 0.22 μm 주사기 필터(30 mL 용량)

다. 시험방법

1) 식품용수 채수

채수할 때는 멸균된 장갑을 착용하여 바이러스가 오염되지 않게 주의하고 오염이 될 수 있는 환경요인들을 피하여야 한다. 멸균된 장갑이 사람의 피부나 오염 가능성이 있는 장치, 부품에 접촉이 되었을 경우 장갑을 바꿔 착용한다(예：수도꼭지나 다른 환경요소 표면).

가) 채수하려는 검체의 배출구(수도꼭지 등)를 2～3분 정도 열고 식품용수를 흘려보낸다. 배출구에 채수호스를 장착 시 누수가 되지 않도록 클램프를 이용하여 단단히 연결하고 탁도가 균일할 때까지 흘려보낸 후 배출구를 잠근다.

나) 염소계소독제(예, HOCl 등)나 불꽃버너를 이용하여 배출구(수도꼭지 등)를 살균 또는 가열한다.

다) 채수용 호스의 알루미늄박을 제거한 후 채수 할 배출구에 연결하고 표준필터장치 용수 유입구(ⓐ)에 호스를 연결한다. 이 단계에서 양전하 카트리지 필터(ⓖ)는 연결하지 않는다.

라) 천천히 배출구를 열어 압력게이지가 200 kPa(30 PSI)가 넘지 않도록 배출구를 조절하고 76 L(20 gal)의 식품용수를 흘려보낸다.

마) 식품용수 76 L를 흘려 보낸 후 일부를 2 L 멸균 비커에 받아 용수의 탁도, pH, 온도, 염소농도를 각 각 측정하여 검체번호, 채수위치, 채수자의 이름과 함께 바이러스 검체채수기록부에 기록한다. pH 측정기는 사용 전 보정(calibration) 한다.

바) 용수 배출구(수도꼭지 등)를 잠그고 검체가 다음의 조건에 해당되어 부가장치의 연결이 필요한지의 여부를 결정하여 연결한다.

(1) pH 8이상일 경우 멸균된 튜브로 단일주입기(ⓑ)와 1 M 염산 용액이 담긴 메스실린더를 연결하고, 배출구(수도꼭지 등)를 다시 열어 용수의 pH가 6.5～7.5가 되도록 단일 주입기를 통해 1 M 염산 용액을 흘려보낸다. 용수유출구(ⓚ)로 흘러나온 용수의 pH를 측정해 바이러스 검체 채수기록부에 기록한다.

(2) 잔류염소 제거를 위해 위와 같이 단일주입기를 연결하여 식품용수 3.8 L(1 gal) 당 2% 티오황산나트륨 용액 10 mL이 주입되도록 한다.

* (1)과 (2)번이 모두 해당할 경우 이중주입기를 연결하여 사용한다.

사) 바이러스검체 채수기록부에 검체 채취일, 시작 시간, 유량계의 초기 수치를 기록한다.

아) 알루미늄박을 제거한 양전하 카트리지 필터를 탈리액 주입구(ⓔ)와 유출구(ⓘ) 사이에 연결한다.

자) 용수를 천천히 흐르게 하면서 카트리지 하우징 상단의 감압단추(ⓕ, vent button)를 눌러 내부공기가 완전히 빠지도록 한 후, 수도꼭지를 완전히 열어 준다.

차) 압력게이지가 200 kPa(30 PSI) 이하로 유지되도록 유량조절 밸브를 조정하고 식품용수 1,500～1,800 L를 통과시킨 후, 용수 배출구(수도꼭지 등)를 잠근다.

카) 바이러스 검체 채수기록부에 검체채취 종료일, 종료 시간, 유량계의 최종 수치 등을 기록한다.

타) 표준필터장치로부터 카트리지 하우징(ⓗ)을 분리하고 양전하 카트리지 필터를 거꾸로 하여 남은 물을 버린 후 하우징 양끝의 연결된 개구부를 멸균된 알루미늄박으로 싼다.

파) 양전하 카트리지 필터를 아이스박스에 담고 얼음팩 등을 사용하여 냉장상태(냉동시켜서는 아니 된다)로 유지하여 즉시 실험실로 운반한다.

2) 바이러스 탈리과정

가) 냉장 보관하여 운반한 필터는 채수 시작 시간부터 24시간 내에 실험실에서 바이러스 탈리 시험을 실시하여야 한다. 다만, 부득이한 경우로 인해 24시간 내에 탈리시험이 불가할 경우 최대 72시간이 넘지 않도록 한다.

나) 탈리용 거치대에 카트리지 하우징을 장착한 후 유량조절 밸브를 모두 닫는다.

다) 탈리액 주입구에 연동정량펌프 호스를 연결한 후 연동정량펌프와 1.5% Beef extract 용액이 채워져 있는 유리병에 호스를 차례로 연결하되, 1-MDS 필터는 1 L, NanoCeram 필터에는 0.5 L의 1.5% Beef extract 용액을 사용한다.

라) 탈리액 유출구에 유출용 호스를 연결하여 1.5% Beef extract 용액이 들어 있는 유리병에 넣고 탈리액 유출구를 닫는다.

마) 연동정량펌프를 가동하여 양전하 카트리지 필터 하우징 안으로 1.5% Beef extract 용액이 양전하 카트리지 필터 내에 완전히 차도록 한 후 감압단추를 통해 1.5% Beef extract 용액이 넘쳐 흘러나오기 시작하면 감압단추에서 손을 떼고, 연동정량펌프 가동을 멈춘 후 5분간 정치한다.

※ 감압단추는 탈리액이 양전하 카트리지 필터 안으로 가득 채워질 때까지 눌러준다.

바) 탈리액 유출구를 열고 연동정량펌프를 다시 가동한 후 하우징에 채워져 있는 1.5% Beef extract 용액이 서서히 필터를 통과하도록 한다. 통과한 완충액은 1.5% Beef extract 용액이 들어있던 유리병에 수집한다. 탈리액을 회수할 때는 거품이 없도록 주의하여야 한다.

※ 연동정량펌프 대신 양압펌프와 압력통을 사용하여 탈리과정을 진행할 수도 있다.

사) 유리병에 수집된 탈리액은 라)～바)의 과정을 2회 반복한다.

아) 최종 탈리액은 1 M 염산 용액으로 pH를 7.0～7.5 사이로 조절하고 멸균된 메스실린더를 사용하여 부피를 기록한다.

자) 탈리액은 24시간 이내에 농축시험이 가능할 경우 4℃에서 보관하며, 농축 시험을 즉시 시행하기 어려울 때에는 -70℃에서 보관한다.

3) 바이러스 농축과정

가) 최종 탈리액을 교반기에서 혼합하면서 1 M 염산용액으로 pH를 3.5±0.1로 조절한 후, 실온에서 30분간 천천히 섞는다.

나) 침전물이 생기면 탈리액을 멸균한 원심분리용기에 옮겨 원심분리한다(2,500 G 15분, 4℃).

다) 원심분리 후, 상등액을 제거하고 남은 침전물에 0.15 M sodium phosphate 완충액(pH 9.0～9.5)을  20～30 mL 넣어 완전히 부유 시킨 후 실온에 10분간 방치한다.

라) 부유시킨 용액을 원심분리한다(7,000 G, 10분, 4℃).

마) 상등액을 취해 1 M 염산용액으로 pH 7.0～7.5로 조절한다.

바) 미생물오염을 방지하기 위해 30 mL 주사기를 이용하여 상등액을 0.22 μm 주사기 필터로 여과한다. 검체 중의 바이러스가 필터에 흡착되는 것을 방지하기 위하여 사전에 0.22 μm 주사기 필터에 10～20 mL의 1.5% Beef extract 용액(pH 7.0～7.5)을 통과시킨다.

사) 최종 농축 검체량(FCSV=final concentrated sample volume)을 기록하고 검체를 24시간 이내에 분석할 경우는 4℃에 보관하고 나머지는 분석 전까지 -70℃에 보관한다.

아) 최종 농축검체 20～30 mL는 바이러스 유전자 추출을 위한 검체로 사용한다.

4) 바이러스 유전자 추출 과정

시판되는 바이러스 DNA 추출 키트(kit)를 사용하며, 제조사가 제시하는 적절한 실험법에 따라 실시한다.

※ 또한 자동유전자 추출장치를 사용할 경우에도 바이러스 추출 키트를 사용하여 바이러스 유전자를 추출할 수 있다.

가) 바이러스 유전자 추출 시 검체와 동일한 과정으로 음성대조군(negative control)을 사용하여 유전자를 추출하며 검체의 경우 시험 진행 중 오염 여부를 확인하기 위해 2개의 DNA를 추출한다.

나) 검체 농축액과 음성대조군 각 300 μL에 Lysis-Binding solution buffer 600 μL를 넣어 혼합하고 가볍게 원심분리한 후 실온에서 5분 동안 방치한다.

다) 여기에 Magnetic bead를 40 μL를 넣어 혼합한 후 상온에서 10분간 방치한다.

라) Magnetic trapper에 튜브를 장착한 후 상층액을 모두 제거한다.

마) Magnetic trapper에서 튜브를 꺼내 Washing 1 solution 600 μL를 넣고 세척한 후 다시 trapper에 장착하여 상층액을 모두 제거한다.

바) Trapper에서 튜브를 꺼내어 Washing 2 solution 600 μL를 첨가하여 세척하고 다시 trapper에 장착하여 상층액을 모두 제거한다.

사) Trapper에서 튜브를 꺼내어 Washing 3 solution 600 μL를 첨가하여 세척하고 다시 trapper에 장착하여 상층액을 모두 제거한다.

아) Elution buffer 160 μL를 넣고 5분간 실온 방치한다.

자) Trapper에서 튜브를 꺼내어 60℃에서 10분간 방치한 후 다시 trapper에 장착하여 상층액을 취하며 PCR을 수행하기 위한 주형(template)으로 사용한다.

5) 장관아데노바이러스 유전자 PCR 과정 및 결과판정

PCR(Polymerase chain reaction)과정에서는 장관아데노바이러스를 인위적으로 조합하여 합성한 DNA 등을 PCR 양성대조군으로 사용할 수 있다.

가) PCR 방법은 아래와 같이 수행한다.

(1) PCR 조성조건은 표 1과 같이 추출 DNA 5 μL, 10x 완충액(MgCl2 포함) 5 μL, dNTPs(10 mM) 4 μL, Taq DNA polymerase 1 μL, 프라이머(AD1, AD2)는 각 1 μL 첨가한 다음 최종 증류수로 총 50 μL로 맞춘 후 PCR을 실시한다.

(2) PCR 반응조건은 표 2와 같이 94℃에서 3분간 DNA를 변성시키고 94℃ 30초, 50℃ 30초, 72℃ 1분을 1회로 하여 35회를 반응시킨 후 72℃에서 5분간 연장 반응시킨다.

표 1. 장관아데노바이러스 PCR 반응액 조성

Component	Volume	Primer
dNTPs(10mM)	4 μL	-
10x Buffer(with MgCl2)	5 μL	-
D.W.	33 μL	-
Forward primer(10 pmol)	1 μL	AD1
Reverse primer(10 pmol)	1 μL	AD2
Taq DNA polymerase	1 μL	-
DNA	5 μL	-
Total	50 μL

표 2. 장관아데노바이러스 PCR 반응조건 및 온도

	온도	시간	cycle
초기 변성 (predenaturation)	94℃	3 min	1 cycle
변성(denaturation) 결합(annealing) 확장(extension)	94℃ 50℃ 72℃	30 sec 30 sec 1 min	35 cycles
최종신장(post-elongation)	72℃	5 min	1 cycle
보관	4℃	∞	∞

(3) PCR 반응 종료 후 PCR 증폭 반응액 5 μL를 전기영동 완충액(gel loading buffer) 1 μL와 혼합한 다음 젤(gel)의 각 홈에 검체를 조심스럽게 넣고 나머지 한 홈에 PCR 증폭산물의 크기를 식별하기에 적당한 표식 DNA(marker DNA) 7 μL를 넣는다. 1.5% 아가로스 젤(agarose gel) 상에서 100V로 전기영동한 후 Ethidium Bromide(EtBr) 염색액(10 mg/mL)으로 30분간 염색한 후 증류수로 10분간 탈색하고 자외선 조사기(UV transilluminator)로 조사하여 증폭된 DNA 밴드를 관찰한다.

(4) 장관아데노바이러스 유전자 증폭에 사용하는 프라이머는 표 3와 같다.

표 3. 장관아데노바이러스 PCR 프라이머 염기서열

Primer	Sequence(5'→3')	Application	PCR Size(bp)
AD1	TTC CCC ATG GCI CAY AAC AC	PCR/sequencing	482
AD2	CCC TGG TAK CCR TRT TGT A

다) 1차 결과 확인

(1) 아가로즈 젤(agarose gel)상에서 시료에 PCR 밴드의 크기가 482 bp로 확인 될 경우 장관아데노바이러스로 일차 확인한다.

(2) 만일 음성대조군(negative control)에서 PCR 밴드가 확이 될 경우 등은 재시험을 실시해야한다(표 4 참고).

(3) 장관아데노바이러스가 일차 확인된 경우 최종 확인을 위하여 아가로스 젤(agarose gel)상에서 해당부위를 절취하여 PCR 산물을 정제한 후 염기서열(DNA sequencing)을 분석하여 최종 판정한다.

표 4. 장관아데노바이러스 PCR 결과판정(예시)

	추출 DNA(시료)	음성대조군	1차 판정
1	+	-	PCR 검출
	+
2	+	-	PCR 검출
	-
3	+	+	재 실험
	+
4	-	-	PCR 불검출
	-

+ : 장관아데노바이러스 PCR 밴드 확인됨, - : 밴드가 확인되지 않음

라) 최종 검출 판정

(1) 염기서열 분석(DNA sequencing)을 위하여 다)의 (3)에서 정제된 DNA 1 μL를 주형으로 AD1과 AD2 프라이머를 사용한다.

(2) 염기서열 분석(sequencing) 반응을 위한 혼합 조건은 각 유전자형 Semi-nested 프라이머(primer, 1 pmol)를 독립된 각각의 튜브에 2 μL, dye-terminator 2 μL, 정제 DNA 2 μL를 첨가하여 증류수로 최종 10 μL가 되도록 하고 96℃에서 1분간 DNA를 변성시킨 후, 96℃에서 10초간, 50℃에서 5초간, 60℃에서 4분간을 1회로 하여 25회 반응시킨 다음 60℃에서 10분간 연장반응을 시킨다.

(3) PCR 산물은 염기서열 분석(DNA sequencing)하되 2종 이상의 유전자가 혼합되어 있는 경우에는 클로닝 염기서열 분석(Cloning DNA sequencing)을 재실시 한다. 염기서열 분석(DNA sequencing)에 의해 결정된 염기서열은 장관아데노바이러스 유전자 데이터베이스(Referecne sequence 및 NCBI blast)와 비교하여 장관아데노바이러스로 확인되었을 경우 검출된 것으로 최종 확인한다.

제7. 4.31을 다음과 같이 신설한다.

4.31 식품용수 등의 사포바이러스

가. 시약 및 시액

1) 2% 티오황산나트륨(Sodium thiosulfate: Na2S2O3) 용액

4,800 mL의 증류수에 티오황산나트륨 100 g을 녹여 최종 5,000 mL의 용액을 제조하고 121℃, 15분간 고압증기 멸균한다.

2) 1M 염산(HCl) 용액

1M 염산(HCl) 용액은 식품용수 채수 시 검체의 pH를 조정하는데 사용한다.

3) 1.5% Beef extract(desiccated powder) 용액

1,900 mL의 증류수에 Beef extract 분말 30 g과 glycine 7.5 g(최종농도 = 0.05 M)을 넣고 1M NaOH를 이용하여 pH 9.5로 조정한 후 최종 2 L로 제조하고 121℃, 15분간 고압증기 멸균한다. Beef extract 용액은 4℃에서 일주일간 혹은 -20℃에서 장기간동안 보관할 수 있다.

4) 0.15 M 인산일수소나트륨, 7수화물(Sodium phosphate, dibasic, (Na2HPO4  7H2O)) 용액

950 mL의 증류수에 Sodium phosphate 40.2 g을 넣고 1M  NaOH를 이용하여 pH 9.5로 조정한 후 최종 1 L로 제조하고 121℃, 15분간 고압증기 멸균한다.

5) 1M 수산화나트륨(NaOH) 용액

400 mL의 증류수에 20 g의 수산화나트륨을 넣고 최종 500 mL로 제조하여 수산화나트륨 용액을 준비한다. 수산화나트륨 용액은 상온에서 수개월 동안 보관할 수 있다.

6) 바이러스 유전자 추출 키트(Viral RNA Mini Kits)

시판되는 바이러스 RNA 추출 키트(kit)를 사용한다.

※ 재현성 및 검출효율 등을 고려하여 QIAGEN-Viral RNA Mini Kits 또는 동등 이상의 제품사용 가능

나. 장치 및 기구

1) 검체 채수과정

가) 표준필터장치：식품용수 1,500∼1,800 L을 채수하는 장치

구성 : 용수 유입구, 단일주입기, 유량조절밸브, 압력게이지, 탈리액 주입구, 양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter), 카트리지 하우징(cartridge housing), 탈리액 유출구, 유량계, 용수 유출구

※ 양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter) : 1-MDS, NanoCeram 또는 이와 동등한 것

나) 휴대용 pH 측정기：식품용수의 수소이온농도를 측정한다.

다) 휴대용 탁도 측정기：식품용수의 혼탁도를 측정한다.

라) 휴대용 염소 농도 측정기：식품용수의 잔류염소농도를 측정한다.

마) 휴대용 아이스박스：식품용수 채수 후 양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter)를 운반하기 위해 사용한다.

바) 상업용 얼음팩：양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter) 운반 시 냉장상태 유지용으로 사용한다.

사) 기타：공구상자, 2 L 멸균 비커, 멸균된 알루미늄박, 클램프, 바이러스시료 검체기록부, 멸균장갑, 수은온도계, 멸균 메스실린더, 채수용 호스

ⓐ 용수 유입구 ⓑ 단일주입기 ⓒ 유량조절밸브 ⓓ 압력게이지 ⓔ 탈리액 주입구 ⓕ 감압단추 ⓖ 양전하 카트리지 필터 ⓗ 카트리지 하우징 ⓘ 탈리액 유출구 ⓙ 유량계 ⓚ 용수 유출구

《표준필터장치》

2) 바이러스 탈리과정

가) 연동정량펌프：1.5% 양전하 카트리지 필터로 유입시켜 흡착된 바이러스를 탈리하기 위한 장치

나) 연동정량펌프 탈리액 유입용 호스, 탈리액 유출용 호스

다) 자석교반기 및 자석교반 막대

라) 하우징 거치대, 탈리액 유입구, 탈리액 유출구, 압력게이지

3) 바이러스 농축과정

가) 원심분리기(4 ℃, 2,500∼10,000 G)

나) 원심분리용기(50∼500 mL 용량)

다) 0.22 μm 주사기 필터(30 mL 용량)

다. 시험방법

1) 식품용수 채수

채수할 때는 멸균된 장갑을 착용하여 바이러스가 오염되지 않게 주의하고 오염이 될 수 있는 환경요인들을 피하여야 한다. 멸균된 장갑이 사람의 피부나 오염 가능성이 있는 장치, 부품에 접촉이 되었을 경우 장갑을 바꿔 착용한다(예：수도꼭지나 다른 환경요소 표면).

가) 채수하려는 검체의 배출구(수도꼭지 등)를 2～3분 정도 열고 식품용수를 흘려보낸다. 배출구에 채수호스를 장착 시 누수가 되지 않도록 클램프를 이용하여 단단히 연결하고 탁도가 균일할 때까지 흘려보낸 후 배출구를 잠근다.

나) 염소계소독제(예, HOCl 등)나 불꽃버너를 이용하여 배출구(수도꼭지 등)를 살균 또는 가열한다.

다) 채수용 호스의 알루미늄박을 제거한 후 채수 할 배출구에 연결하고 표준필터장치 용수 유입구(ⓐ)에 호스를 연결한다. 이 단계에서 양전하 카트리지 필터(ⓖ)는 연결하지 않는다.

라) 천천히 배출구를 열어 압력게이지가 200 kPa(30 PSI)가 넘지 않도록 배출구를 조절하고 76 L(20 gal)의 식품용수를 흘려보낸다.

마) 식품용수 76 L를 흘려 보낸 후 일부를 2 L 멸균 비커에 받아 용수의 탁도, pH, 온도, 염소농도를 각 각 측정하여 검체번호, 채수위치, 채수자의 이름과 함께 바이러스 검체채수기록부에 기록한다. pH 측정기는 사용 전 보정(calibration) 한다.

바) 용수 배출구(수도꼭지 등)를 잠그고 검체가 다음의 조건에 해당되어 부가장치의 연결이 필요한지의 여부를 결정하여 연결한다.

(1) pH 8이상일 경우 멸균된 튜브로 단일주입기(ⓑ)와 1 M 염산 용액이 담긴 메스실린더를 연결하고, 배출구(수도꼭지 등)를 다시 열어 용수의 pH가 6.5～7.5가 되도록 단일 주입기를 통해 1 M 염산 용액을 흘려보낸다. 용수유출구(ⓚ)로 흘러나온 용수의 pH를 측정해 바이러스 검체 채수기록부에 기록한다.

(2) 잔류염소 제거를 위해 위와 같이 단일주입기를 연결하여 식품용수 3.8 L(1 gal) 당 2% 티오황산나트륨 용액 10 mL이 주입되도록 한다.

* (1)과 (2)번이 모두 해당할 경우 이중주입기를 연결하여 사용한다.

사) 바이러스검체 채수기록부에 검체 채취일, 시작 시간, 유량계의 초기 수치를 기록한다.

아) 알루미늄박을 제거한 양전하 카트리지 필터를 탈리액 주입구(ⓔ)와 유출구(ⓘ) 사이에 연결한다.

자) 용수를 천천히 흐르게 하면서 카트리지 하우징 상단의 감압단추(ⓕ, vent button)를 눌러 내부공기가 완전히 빠지도록 한 후, 수도꼭지를 완전히 열어 준다.

차) 압력게이지가 200 kPa(30 PSI) 이하로 유지되도록 유량조절 밸브를 조정하고 식품용수 1,500～1,800 L를 통과시킨 후, 용수 배출구(수도꼭지 등)를 잠근다.

카) 바이러스 검체 채수기록부에 검체채취 종료일, 종료 시간, 유량계의 최종 수치 등을 기록한다.

타) 표준필터장치로부터 카트리지 하우징(ⓗ)을 분리하고 양전하 카트리지 필터를 거꾸로 하여 남은 물을 버린 후 하우징 양끝의 연결된 개구부를 멸균된 알루미늄박으로 싼다.

파) 양전하 카트리지 필터를 아이스박스에 담고 얼음팩 등을 사용하여 냉장상태(냉동시켜서는 아니 된다)로 유지하여 즉시 실험실로 운반한다.

2) 바이러스 탈리과정

가) 냉장 보관하여 운반한 필터는 채수 시작 시간부터 24시간 내에 실험실에서 바이러스 탈리 시험을 실시하여야 한다. 다만, 부득이한 경우로 인해 24시간 내에 탈리시험이 불가할 경우 최대 72시간이 넘지 않도록 한다.

나) 탈리용 거치대에 카트리지 하우징을 장착한 후 유량조절 밸브를 모두 닫는다.

다) 탈리액 주입구에 연동정량펌프 호스를 연결한 후 연동정량펌프와 1.5% Beef extract 용액이 채워져 있는 유리병에 호스를 차례로 연결하되, 1-MDS 필터는 1 L, NanoCeram 필터에는 0.5 L의 1.5% Beef extract 용액을 사용한다.

라) 탈리액 유출구에 유출용 호스를 연결하여 1.5% Beef extract 용액이 들어 있는 유리병에 넣고 탈리액 유출구를 닫는다.

마) 연동정량펌프를 가동하여 양전하 카트리지 필터 하우징 안으로 1.5% Beef extract 용액이 양전하 카트리지 필터 내에 완전히 차도록 한 후 감압단추를 통해 1.5% Beef extract 용액이 넘쳐 흘러나오기 시작하면 감압단추에서 손을 떼고, 연동정량펌프 가동을 멈춘 후 5분간 정치한다.

※ 감압단추는 탈리액이 양전하 카트리지 필터 안으로 가득 채워질 때까지 눌러준다.

바) 탈리액 유출구를 열고 연동정량펌프를 다시 가동한 후 하우징에 채워져 있는 1.5% Beef extract 용액이 서서히 필터를 통과하도록 한다. 통과한 완충액은 1.5% Beef extract 용액이 들어있던 유리병에 수집한다. 탈리액을 회수할 때는 거품이 없도록 주의하여야 한다.

※ 연동정량펌프 대신 양압펌프와 압력통을 사용하여 탈리과정을 진행할 수도 있다.

사) 유리병에 수집된 탈리액은 라)～바)의 과정을 2회 반복한다.

아) 최종 탈리액은 1 M 염산 용액으로 pH를 7.0～7.5 사이로 조절하고 멸균된 메스실린더를 사용하여 부피를 기록한다.

자) 탈리액은 24시간 이내에 농축시험이 가능할 경우 4℃에서 보관하며, 농축 시험을 즉시 시행하기 어려울 때에는 -70℃에서 보관한다.

3) 바이러스 농축과정

가) 최종 탈리액을 교반기에서 혼합하면서 1 M 염산용액으로 pH를 3.5±0.1로 조절한 후, 실온에서 30분간 천천히 섞는다.

나) 침전물이 생기면 탈리액을 멸균한 원심분리용기에 옮겨 원심분리한다(2,500 G 15분, 4℃).

다) 원심분리 후, 상등액을 제거하고 남은 침전물에 0.15 M sodium phosphate 완충액(pH 9.0～9.5)을 20～30 mL 넣어 완전히 부유 시킨 후 실온에 10분간 방치한다.

라) 부유시킨 용액을 원심분리한다(7,000 G, 10분, 4℃).

마) 상등액을 취해 1 M 염산용액으로 pH 7.0～7.5로 조절한다.

바) 미생물오염을 방지하기 위해 30 mL 주사기를 이용하여 상등액을 0.22 μm 주사기 필터로 여과한다. 검체 중의 바이러스가 필터에 흡착되는 것을 방지하기 위하여 사전에 0.22 μm 주사기 필터에 10～20 mL의 1.5% Beef extract 용액(pH 7.0～7.5)을 통과시킨다.

사) 최종 농축 검체량(FCSV=final concentrated sample volume)을 기록하고 검체를 24시간 이내에 분석할 경우는 4℃에 보관하고 나머지는 분석 전까지 -70℃에 보관한다.

아) 최종 농축검체 20～30 mL는 바이러스 유전자 추출을 위한 검체로 사용한다.

4) 바이러스 유전자 추출 과정

시판되는 바이러스 RNA 추출 키트(kit)를 사용하며, 제조사가 제시하는 적절한 실험법에 따라 실시한다.

※ 재현성 및 검출효율 등을 고려하여 QIAGEN-Viral RNA Mini Kits 또는 동등 이상의 제품이 사용이 가능하며, 또한 자동유전자 추출장치를 사용할 경우에도 바이러스 RNA 추출 키트를 사용하여 바이러스 유전자를 추출할 수 있다.

가) 바이러스 유전자 추출 시 검체와 동일한 과정으로 음성대조군(negative control)을 사용하여 유전자를 추출하며 검체의 경우 시험 진행 중 오염 여부를 확인하기 위해 2개의 RNA를 추출한다.

나) 검체 농축액과 음성대조군 각 280 μL에 AVL 완충액(guanidine thiocyanate 함유) 1,120 μL를 각각 혼합하여 실온에서 10분 동안 방치한 후 가볍게 원심분리기를 이용하여 원심분리(spin-down)한다.

다) 여기에 95～100% 에탄올 1,120 μL을 넣어 혼합한 후 가볍게 원심분리(spin-down)한다.

라) 혼합액 630 μL을 소량 원심(Mini spin) 컬럼으로 옮겨 6,000 G에서 1분간 원심분리하고 컬럼을 새로운 회수용(collection) 튜브로 옮긴 다음 남은 혼합액을 630 μL씩 동일한 방법으로 컬럼에 첨가하여 원심분리한다.

마) 소량 원심(Mini spin) 컬럼을 새로운 회수용(collection) 튜브로 옮겨 AW1 완충액(guanidine hydrochloride 함유) 500 μL을 넣고 6,000 G로 1분간 원심분리 후 컬럼을 새로운 회수용(collection) 튜브로 옮긴다.

바) AW2 완충액 500 μL을 넣고 20,000 G로 3분간 원심분리한 후 컬럼을 새로운 1.5 mL 회수용(collection) 튜브로 옮긴다.

사) AVE 완충액(sodium azide 함유) 60 μL를 넣고 6,000 G로 1분간 원심분리하여 다음의 RT-PCR(Reverse transcription-Polymerase chain reaction)을 수행하기 위한 주형(template)으로 사용한다.

5) 사포바이러스 유전자 PCR 과정 및 결과판정

RT-PCR(Reverse transcription-PCR)과정에서는 사포바이러스를 인위적으로 조합하여 합성한 RNA 등을 PCR 양성대조군으로 사용할 수 있다.

가) One-step RT-PCR(Reverse transcription-PCR) 방법은 아래와 같이 수행한다.

(1) One-step RT-PCR(Reverse transcription-PCR) 조성조건은 표 1과 같이 Mastermix(2X) 9.5 μL, Reverse transcriptase(50unit/μL) 0.5 μL, 프라이머(SV-F11, SV-R1)는 각 2 μL, 추출 RNA 5 μL를 첨가하여 증류수로 총 25 μL로 맞추고 반응시킨다.

(2) One-step RT-PCR(Reverse transcription-PCR) 반응조건은 표 2와 같이 45℃에서 30분, 94℃에서 5분 변성시키고, 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분 30초를 1회로 하여 35회 반응시킨 후, 72℃에서 7분간 연장 반응시킨다. 상기 반응 종료 후 PCR 생성물에 대하여 Nested PCR을 실시한다.

표 1. 사포바이러스 One-step RT-PCR(Reverse transcription-PCR) 반응액 조성

Component	Volume	Primers
Mastermix(2X)	9.5 μL	-
Reverse transcriptase(50unit/μL)	0.5 μL	-
D.W.	6μL	-
Forward primer(20pmol)	2 μL	SV-F11
Reverse primer(20pmol)	2 μL	SV-R1
Extracted RNA, PCR control	5 μL	-
Total	25μL	-

표 2. 사포바이러스 One-step RT-PCR(Reverse transcription-PCR)  반응조건 및 온도

	온도	시간	Cycle
cDNA 합성(cDNA synthesis) 초기 변성(predenaturation)	45℃ 94℃	30 min 5 min	1 cycle
변성(denaturation) 결합(annealing) 확장(extension)	94℃ 55℃ 72℃	30 sec 30 sec 1 min 30 sec	35 cycles
최종신장(post-elongation)	72℃	7 min	1 cycle
보관	4℃	∞	∞

나) Nested PCR 방법은 아래와 같이 수행한다.

(1) One-step RT-PCR(Reverse transcription-PCR) 산물을 주형으로 하여 표 3과 같이 Nested PCR을 실시한다. 1차 PCR산물 2 μL, 10x 완충액(MgCl2 포함) 5 μL, dNTPs(10 mM) 4 μL, Taq DNA polymerase(5 unit/μL) 1 μL, 프라이머(SV-F21, SV-R2)는 각 2.5 μL 첨가한 다음 최종 증류수로 총 50 μL로 맞춘 후 Nested PCR을 실시한다.

(2) PCR 반응조건은 표 4와 같이 94℃에서 5분간 DNA를 변성시키고 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분 30초를 1회로 하여 25회를 반응시킨 후 72℃에서 7분간 연장 반응시킨다.

표 3. 사포바이러스 Nested PCR 반응액 조성

Component	Volume	Primers
dNTPs(10mM)	4 μL	-
10x Buffer(with MgCl2)	5 μL	-
D.W.	33 μL	-
Forward primer(20 pmol)	2.5 μL	SV-F21
Reverse primer(20 pmol)	2.5 μL	SV-R2
Taq DNA polymerase(5 unit/μL)	1 μL	-
1st PCR Product	2 μL	-
Total	50 μL

표 4. 사포바이러스 Nested PCR 반응조건 및 온도

	온도	시간	cycle
초기 변성 (predenaturation)	94℃	5 min	1 cycle
변성(denaturation) 결합(annealing) 확장(extension)	94℃ 55℃ 72℃	30 sec 30 sec 1 min 30 sec	30 cycles
최종신장(post-elongation)	72℃	7 min	1 cycle
보관	4℃	∞	∞

(3) PCR 반응 종료 후 PCR 증폭 반응액 5 μL를 전기영동 완충액(gel loading buffer) 1 μL와 혼합한 다음 젤(gel)의 각 홈에 검체를 조심스럽게 넣고 나머지 한 홈에 PCR 증폭산물의 크기를 식별하기에 적당한 표식 DNA(marker DNA) 7 μL를 넣는다. 1.5% 아가로스 젤(agarose gel) 상에서 100V로 전기영동한 후 Ethidium Bromide(EtBr) 염색액(10 mg/mL)으로 30분간 염색한 후 증류수로 10분간 탈색하고 자외선 조사기(UV transilluminator)로 조사하여 증폭된 DNA 밴드를 관찰한다.

(4) 사포바이러스 유전자 증폭에 사용하는 프라이머는 표 5와 같다.

표 5. 사포바이러스 PCR 프라이머 염기서열

Primer	Sequence(5'→3')	Application	PCR Size(bp)
SV-F11	GCY TGG TTY ATA GGT GGT AC	One-step RT-PCR	781
SV-R1	CWG GTG AMA CMC CAT TKT CCA T
SV-F21	ANT AGT GTT TGA RAT GGA GGG	Nested PCR/ Sequencing	415
SV-R2	GWG GGR TCA ACM CCW GGT GG

다) 1차 결과 확인

(1) 아가로즈 젤(agarose gel)상에서 시료에 PCR 증폭산물이 415 bp의 밴드가 있을 경우 사포바이러스로 일차 확인한다.

(2) 만일 음성대조군(negative control)에서 PCR 밴드가 확이 될 경우 등은 재시험을 실시해야한다(표 6 참고).

(3) 사포바이러스가 일차 확인된 경우 최종 확인을 위하여 아가로스 젤(agarose gel)상에서 해당부위를 절취하여 PCR 산물을 정제한 후 염기서열(DNA sequencing)을 분석하여 최종 판정한다.

표 6. 사포바이러스 PCR 결과판정(예시)

	추출 RNA(시료)	음성대조군	1차 판정
1	+	-	PCR 검출
	+
2	+	-	PCR 검출
	-
3	+	+	재 실험
	+
4	-	-	PCR 불검출
	-

+ : 사포바이러스 PCR 밴드 확인됨, - : 밴드가 확인되지 않음

라) 최종 검출 판정

(1) 염기서열 분석(DNA sequencing)을 위하여 다)의 (3)에서 정제된 DNA 1 μL를 주형으로  SV-F21과 SV-R2 프라이머를 사용한다.

(2) 염기서열 분석(sequencing) 반응을 위한 혼합 조건은 각 유전자형 Nested 프라이머(primer, 1 pmol)를 독립된 각각의 튜브에 2 μL, dye-terminator 2 μL, 정제 DNA 2 μL를 첨가하여 증류수로 최종 10 μL가 되도록 하고 96℃에서 1분간 DNA를 변성시킨 후, 96℃에서 10초간, 50℃에서 5초간, 60℃에서 4분간을 1회로 하여 25회 반응시킨 다음 60℃에서 10분간 연장반응을 시킨다.

(3) PCR 산물은 염기서열 분석(DNA sequencing)하되 2종 이상의 유전자가 혼합되어 있는 경우에는 클로닝 염기서열 분석(Cloning DNA sequencing)을 재실시 한다. 염기서열 분석(DNA sequencing)에 의해 결정된 염기서열은 사포바이러스 유전자 데이터베이스(Referecne sequence 및 NCBI blast)와 비교하여 사포바이러스로 확인되었을 경우 검출된 것으로 최종 확인한다.

제7. 10 중 10.4를 다음과 같이 한다.

10.4 발기부전치료제 및 그 유사물질

가. 시험법 적용범위

모든 식품에 적용한다.

나. 분석원리

균질화한 검체를 취하여 액-액 추출하고 액체크로마토그래프/ 자외부흡광검출기(UV photometric detector), PDA 검출기로 분석한다.

다. 장치

1) 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기(LC/UV photometric detector), PDA 검출기(LC/PDA), 액체크로마토그래프/질량분석기(LC/MS)를 사용한다.

라. 시약 및 시액

1) 유기용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

2) 물 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액 : 호모실데나필(homosildenafil), 홍데나필(hongdenafil), 하이드록시호모실데나필(hydroxyhomosildenafil), 아미노타다라필(aminotadalafil), 슈도바데나필(pseudovardenafil), 하이드록시홍데나필(hydroxyhongdenafil),  디메틸실데나필(dimethylsildenafil), 잔소안트라필(xanthoanthrafil), 하이드록시바데나필(hydroxyvardenafil), 노르네오실데나필(norneosildenafil), 데메틸홍데나필(demethylhongdenafil), 피페리디노홍데나필(piperidinohongdenafil), 카보데나필(carbodenafil), 치오실데나필,(thiosildenafil) 디메틸치오실데나필(dimethylthiosildenafil), 아세틸바데나필(acetylvardenafil), 벤질실데나필(benzylsildenafil), 노르네오바데나필(norneovardenafil), 옥소홍데나필(oxohongdenafil), 클로로데나필(chlorodenafil), 신나밀데나필(cinnamyldenafil), 치오호모실데나필(thiohomosildenafil), 데설포바데나필(desulfovardenafil), 니트로데나필(nitrodenafil), 싸이클로펜티나필(cyclopenpentynafil), 옥틸노르타다라필(octylnortadalafil), 치오퀴나피페리필(thioquinapiperifil), 클로로프레타다라필(chloropretadalafil), 하이드록시치오호모실데나필(hydroxythiohomosildenafil), 하이드록시클로로데나필(hydroxychlorodenafil), 디클로로데나필(dichlorodenafil), 데메칠타다라필(demethyltadalafil), 아세트아미노타다라필(acetaminotadalafil), 메틸하이드록시호모실데나필(methylhydroxyhomosildenafil), 프로폭시페닐치오호모실데나필(propoxyphenylthiosildenafil), 프로폭시페닐치오하이드록시호모실데나필(propoxyphenylthiohydroxyhomosildenafil), 프로폭시페닐치오호모실데나필(propoxyphenylthiohomosildenafil), 프로폭시페닐치오아일데나필(propoxyphenylthioaildenafil), 호모타다라필(Homotadalafil), 아세틸산(acetyl acid), 겐데나필(gendenafil), 이미다조사가트리아지논(imidazosagatriazinone), cis-사이클로펜틸타다라필(cis-cyclopentyltadalafil), trans-사이클로펜틸타다라필(trans-cyclopentyltadalafil), 이소프로필노르타다라필(Isopropylnortadalafil), 데스카본실데나필(descarbonsildenafil), 실데나필(sildenafil), 타다라필(tadalafil), 바데나필(vardenafil), 유데나필(udenafil), 미로데나필(mirodenafil), 아바나필(avanafil) 각각의 표준품을 메탄올에 녹여 각각 1,000 mg/L이 되게 한다.

4) 표준용액 : 표준원액을 각각 메탄올에 녹여 1～100 mg/L의 범위가 되도록 적당한 농도로 희석한다.

5) sodium-1-hexane sulfonate : 이온쌍 크로마토그래피용

6) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액의 조제

균질화한 검체 1 g을 정확히 달아 50 mL 용량의 메스플라스크에 넣고 물 15 mL를 가하여 습윤화한다. 메스플라스크에 메탄올 25 mL를 가하여 10분간 초음파 추출한 후 메탄올로 눈금을 채우고 0.45 ㎛ 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 사용한다. 단, 시험용액의 농도가 검량곡선의 농도범위를 벗어날 경우 농도 범위내로 희석하여 사용한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프의 측정조건

가) 칼럼 : C18 (4.6 mm × 250 mm, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

나) 칼럼온도 : 40℃

다) 이동상

(1) 이동상 A : 0.5 mM sodium-1-hexane sulfonate를 함유한 0.1% 인산 용액

(2) 이동상 B : 95% 아세토니트릴

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0	85	15
6	85	15
15	70	30
30	60	40
32	60	40
42	0	100
50	0	100
52	85	15
60	85	15

라) 이동상 유량 : 1.2 mL/min

마) UV 검출기파장 : 291 nm

바) PDA 검출기파장 : 200～400 nm

2) 검량선의 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

3) 표준품의 크로마토그램

4) 정량한계 : 25 mg/kg

사. 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피크는 동일한 측정조건에서 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치하여야 하며 PDA 검출기에서 표준용액과 시험용액이 동일한 스펙트럼을 보여야 한다.

아. 정량시험

정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 시험결과를 피크 높이법 또는 피크 면적법에 따라 정량한다.

1) 계산방법

검량곡선에서 얻어진 표준물질의 피크 높이 또는 피크 면적을 Y축으로 하고 표준물질의 농도를 X축으로 하여 검량곡선을 작성하고 시험용액의 높이 또는 면적을 Y축에 대입하여 발기부전치료제 유사물질의 농도를 계산한다.

발기부전치료제 및 유사물질의 함량(mg/g) = C ×	V	× D
	S

C : 검량곡선에서 계산된 각각의 발기부전치료제 유사물질의 농도 (mg/L)

V : 시험용액의 최종 부피 (L)

S : 검체 채취량 (g)

D : 희석배수

자. 확인시험

액체크로마토그래프/질량분석기로 분석하였을 때 시험용액 중 표준물질의 m/z 값은 표준용액 중 표준물질의 m/z 값과 일치하여야 한다.

1) 액체크로마토그래프/질량분석기의 측정조건

가) 칼럼 : C18 (2.0 mm × 100 mm, 3 ㎛) 또는 이와 동등한 것

나) 칼럼온도 : 40℃

다) 이동상

(1) 이동상 A : 0.1% formic acid를 함유한 물

(2) 이동상 B : 0.1% formic acid를 함유한 아세토니트릴

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0	95	5
3	95	5
20	20	80
21	95	5
25	95	5

라) 이동상 유량 : 0.3 mL/min

마) 이온화 방법 : ESI

바) capillary temperature : 340℃

사) spray voltage : 4.0 kV

차. 발기부전치료제 유사물질의 분자량 및 화학구조식

① 호모실데나필(Homosildenafil) (C23H32N6O4S, 488.61)	② 홍데나필(Hongdenafil) (C25H34N6O3, 466.59)
③ 하이드록시호모실데나필 (Hydroxyhomosildenafil) (C23H32N6O5S, 504.61)	④ 아미노타다라필(Aminotadalafil) (C21H18N4O4, 390.40)
⑤ 슈도바데나필(Pseudovardenafil) (C22H29N5O4S, 459.57)	⑥ 하이드록시홍데나필(Hydroxyhongdenafil) (C25H34N6O4, 482.59)
⑦ 디메틸실데나필(Dimethylsildenafil) (C23H32N6O4S, 488.61)	⑧ 잔소안트라필(Xanthoanthrafil) (C19H23N3O6, 389.41)
⑨ 하이드록시바데나필(Hydroxyvardenafil) (C23H32N6O5S, 504.61)	⑩ 노르네오실데나필(Norneosildenafil) (C22H29N5O4S, 459.57)
⑪ 데메틸홍데나필(Demethylhongdenafil) (C24H32N6O3, 452.55)	⑫ 피페리디노홍데나필(Piperidinohongdenafil) (C24H31N5O3, 437.55)
⑬ 카보데나필(Carbodenafil) (C24H32N6O3, 452.56)	⑭ 치오실데나필(Thiosildenfil) (C22H30N6O3S2, 490.64)
⑮ 디메틸치오실데나필(Dimethylthiosildenafil) (C23H32N6O3S2, 504)	⑯ 아세틸바데나필(Acetylvardenafil) (C25H34N6O3, 466.59)
⑰ 벤질실데나필(Benzylsildenafil) (C28H34N6O4S, 550.68)	⑱ 노르네오바데나필(Norneovardenafil) (C18H20N4O4, 356.38)
⑲ 옥소홍데나필(Oxohongdenafil) (C25H32N6O4, 480.57)	치오호모실데나필(Thiohomosildenafil) (C23H32N6O3S2, 504.68)
데설포바데나필(Desulfovardenafil) (C17H20N4O2, 312.37)	니트로데나필(Nitrodenafil) (C17H19N5O4, 357.37)
싸이클로펜티나필(Cyclopentynafil) (C26H36N6O4S, 528.68)	옥틸노르타다라필(N-Octylnortadalafil) (C29H33N3O4, 487.60)
클로로데나필(Chlorodenafil) (C19H21ClN4O3, 388.86)	신나밀데나필(Cinnamyldenafil) (C32H38N6O3, 554)
치오퀴나피페리필(Thioquinapiperifil) (C24H28N6OS, 448.59)	하이드록시치오호모실데나필 (Hydroxythiohomosildenafil) (C23H32N6O4S2, 520.68)
클로로프레타다라필(Chloropretadalafil) (C22H19ClN2O5, 426.86)	㉚ 하이드록시클로로데나필(Hydroxychlorodenafil) (C19H23ClN4O3, 390.87)
㉛ 디클로로데나필(Dichlorodenafil) (C19H20Cl2N4O2, 407.30)	데메칠타다라필(Demethyltadalafil) (C21H17N3O4, 375.38)
아세트아미노타다라필(Acetaminotadalafil) (C23H20N4O5, 432.43)	㉞ 메틸하이드록시호모실데나필 (Methylhydroxyhomosildenafil) (C24H34N6O5S, 518.00)
㉟ 프로폭시페닐치오호모실데나필 (Propoxyphenylthiohomosildenafil) (C24H34N6O3S2, 518.70)			㊱ 프로폭시페닐치오하이드록시호모실데나필 (Propoxyphenylthiohydroxyhomosildenafil) (C24H34N6O4S2, 534.69)
프로폭시페닐치오실데나필 (Propoxyphenylhiosildenaifl) (C24H32N6O3S2, 504.67)			프로폭시페닐치오아일데나필 (Propoxyphenylhioaildenaifl) (C24H34N6O3S2, 518.70)
㊴ 호모타다라필(Homotadalafil) (C23H21N3O4, 403.43)			아세틸산(Acetyl acid) (C18H20N4O4, 356.38)
겐데나필(Gendenafil) (C19H22N4O3, 354.41)			이미다조사가트리아지논(Imidazosagatriazinone) (C17H20N4O2, 312.37)
cis-사이클로펜틸타다라필(cis-Cyclopentyltadalafil) (C26H25N3O4, 443)			trans-사이클로펜틸타다라필(trans-Cyclopentyltadalafil) (C26H25N3O4, 443)
데스카본실데나필(Descarbonsildenafil) (C21H30N6O4S, 462.57)		이소프로필노르타다라필(Isopropylnortadalafil) (C24H23N3O4, 417.47)

제7. 10 중 10.7.3 ∼ 10.7.6을 다음과 같이 신설한다.

10.7.3 페놀프탈레인(phenolphthalein)

가. 시험법의 적용범위

모든 식품에 적용한다.

나. 분석원리

균질화한 검체를 취하여 액-액 추출하고 액체크로마토그래프/ 자외부흡광검출기(UV photometric detector), PDA 검출기로 분석한다.

다. 장치

1) 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기(LC/UV photometric detector), PDA 검출기(LC/PDA), 액체크로마토그래프/질량분석기(LC/MS)를 사용한다.

라. 시약 및 시액

1) 유기용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

2) 물 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액 : 페놀프탈레인(phenolphthalein) 표준품을 메탄올에 녹여 1,000 mg/L이 되게 한다.

4) 표준용액 : 표준원액을 메탄올에 녹여 1～100 mg/L의 범위가 되도록 적당한 농도로 희석한다.

5) sodium-1-hexane sulfonate : 이온쌍 크로마토그래피용

6) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액의 조제

균질화한 검체 1 g을 정확히 달아 50 mL 용량의 메스플라스크에 넣고 물 15 mL를 가하여 습윤화한다. 메스플라스크에 메탄올 25 mL를 가하여 10분간 초음파 추출한 후 메탄올로 눈금을 채우고 0.45 ㎛ 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 사용한다. 단, 시험용액의 농도가 검량곡선의 농도범위를 벗어날 경우 농도 범위내로 희석하여 사용한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프의 측정조건

가) 컬럼 : C18 (4.6 mm × 250 mm, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

나) 컬럼 온도 : 40℃

다) 이동상

(1) 이동상 A : 0.5 mM sodium-1-hexane sulfonate를 함유한 0.1% 인산 용액

(2) 이동상 B : 95% 아세토니트릴

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0	85	15
6	85	15
15	70	30
30	60	40
32	60	40
42	0	100
50	0	100
52	85	15
60	85	15

라) 이동상 유량 : 1.2 mL/min

마) UV 검출기파장 : 291 nm

바) PDA 검출기파장 : 200～400 nm

2) 검량선의 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

3) 표준품의 크로마토그램 및 스펙트럼

4) 정량한계 : 25 mg/kg

사. 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피크는 동일한 측정조건에서 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치하여야 하며 PDA 검출기에서 표준용액과 시험용액이 동일한 스펙트럼을 보여야 한다.

아. 정량시험

정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 시험결과를 피크 높이법 또는 피크 면적법에 따라 정량한다.

1) 계산방법

검량곡선에서 얻어진 표준물질의 피크 높이 또는 피크 면적을 Y축으로 하고 표준물질의 농도를 X축으로 하여 검량곡선을 작성하고 시험용액의 높이 또는 면적을 Y축에 대입하여 페놀프탈레인의 농도를 계산한다.

시료 중 함량(mg/g) = C ×	V	× D
	S

C : 검량곡선에서 계산된 페놀프탈레인의 농도 (mg/L)

V : 시험용액의 최종 부피 (L)

S : 검체 채취량 (g)

D : 희석배수

자. 확인시험

액체크로마토그래프/질량분석기로 분석하였을 때 시험용액 중 표준물질의 m/z 값은 표준용액 중 표준물질의 m/z 값과 일치하여야 한다.

1) 액체크로마토그래프/질량분석기의 측정조건

가) 컬럼 : C18 (2.0 mm × 100 mm, 3 ㎛) 또는 이와 동등한 것

나) 컬럼온도 : 40℃

다) 이동상

(1) 이동상 A : 0.1% formic acid를 함유한 물

(2) 이동상 B : 0.1% formic acid를 함유한 아세토니트릴

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0	95	5
3	95	5
18	20	80
18.1	0	100
20.9	0	100
21	95	5
25	95	5

라) 이동상 유량 : 0.3 mL/min

마) 이온화 방법 : ESI

바) capillary temperature : 340℃

사) spray voltage : 4.0 kV

아) MRM transition

물질	분자량	Ion mode	Precursor ion (m/z)	Fragment ion (m/z)
페놀프탈레인 (C20H14O4)	318.32	Positive	319	225, 197

10.7.4 요힘빈(yohimbine) 및 이카린(icariin)

가. 시험법의 적용범위

모든 식품에 적용한다.

나. 분석원리

균질화한 검체를 취하여 액-액 추출하고 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기(UV photometric detector), PDA 검출기로 분석한다.

다. 장치

1) 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기(LC/UV photometric detector), PDA 검출기(LC/PDA), 액체크로마토그래프/질량분석기(LC/MS)를 사용한다.

라. 시약 및 시액

1) 유기용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

2) 물 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액 :  요힘빈(yohimbine) 및 이카린(icariin) 표준품을 메탄올에 녹여 각각 1,000 mg/L이 되게 한다.

4) 표준용액 : 표준원액을 각각 메탄올에 녹여 1～100 mg/L의 범위가 되도록 적당한 농도로 희석한다.

5) sodium-1-hexane sulfonate : ion pare 크로마토그래피용

6) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액의 조제

균질화한 검체 1 g을 정확히 달아 50 mL 용량의 메스플라스크에 넣고 물 15 mL를 가하여 습윤화한다. 메스플라스크에 메탄올 25 mL를 가하여 10분간 초음파 추출한 후 메탄올로 눈금을 채우고 0.45 ㎛ 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 사용한다. 단, 시험용액의 농도가 검량곡선의 농도범위를 벗어날 경우 농도 범위내로 희석하여 사용한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프의 측정조건

가) 컬럼 : C18 (4.6 mm × 250 mm, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

나) 컬럼온도 : 40℃

다) 이동상

(1) 이동상 A : 0.5 mM sodium-1-hexane sulfonate를 함유한 0.1% 인산 용액

(2) 이동상 B : 95% 아세토니트릴

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0	85	15
6	85	15
15	70	30
30	60	40
32	60	40
42	0	100
50	0	100
52	85	15
60	85	15

라) 이동상 유량 : 1.2 mL/min

마) UV 검출기파장 : 291 nm

바) PDA 검출기파장 : 200～400 nm

2) 검량선의 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

3) 표준품의 크로마토그램 및 스펙트럼

(a) 요힘빈 및 이카린의 크로마토그램

(b) 요힘빈의 스펙트럼

(c) 이카린의 스펙트럼

4) 정량한계 : 25 mg/kg

사. 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피크는 동일한 측정조건에서 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치하여야 하며 PDA 검출기에서 표준용액과 시험용액이 동일한 스펙트럼을 보여야 한다.

아. 정량시험

정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 시험결과를 피크 높이법 또는 피크 면적법에 따라 정량한다.

1) 계산방법

검량곡선에서 얻어진 표준물질의 피이크높이 또는 피이크면적을 Y축으로 하고 표준물질의 농도를 X축으로 하여 검량곡선을 작성하고 시험용액의 높이 또는 면적을 Y축에 대입하여 요힘빈 및 이카린의 농도를 계산한다.

시료 중 함량(mg/g) = C ×	V	× D
	S

C : 검량곡선에서 계산된 요힘빈, 이카린 각각의 농도 (mg/L)

V : 시험용액의 최종 부피 (L)

S : 검체 채취량 (g)

D : 희석배수

자. 확인시험

액체크로마토그래피-질량분석기로 분석하였을 때 시험용액 중 표준물질의 m/z 값은 표준용액 중 표준물질의 m/z 값과 일치하여야 한다.

1) 액체크로마토그래프/질량분석기의 측정조건

가) 컬럼 : C18 (2.0 mm × 100 mm, 3 ㎛) 또는 이와 동등한 것

나) 컬럼온도 : 40℃

다) 이동상

(1) 이동상 A : 0.1% formic acid를 함유한 물

(2) 이동상 B : 0.1% formic acid를 함유한 아세토니트릴

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0	95	5
3	95	5
18	20	80
18.1	0	100
20.9	0	100
21	95	5
25	95	5

라) 이동상 유량 : 0.3 mL/min

마) 이온화 방법 : ESI

바) capillary temperature : 340℃

사) spray voltage : 4.0 kV

아) MRM transition

물질	분자량	Ion mode	Precursor ion (m/z)	Fragment ion (m/z)
요힘빈(C21H26N2O3)	354.4	Positive	355	144, 212
이카린(C9H13N)	676.7	Negative	677	367, 513

10.7.5 카스카로사이드(Cascaroside A, B, C, D)

가. 시험법의 적용범위

모든 식품에 적용한다.

나. 분석원리

균질화한 검체를 취하여 액-액 추출하고 액체크로마토그래프/ 자외부흡광검출기(UV photometric detector), PDA 검출기로 분석한다.

다. 장치

1) 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기(LC/UV photometric detector), PDA 검출기(LC/PDA), 액체크로마토그래프/질량분석기(LC/MS)를 사용한다.

라. 시약 및 시액

1) 유기용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

2) 물 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액 : 카스카로사이드 A(cascaroside A), 카스카로사이드 B(cascaroside B), 카스카로사이드 C(cascaroside C), 카스카로사이드 D(cascaroside D) 표준품을 각각 메탄올에 녹여 1,000 mg/L이 되게 한다.

4) 표준용액 : 표준원액을 메탄올에 녹여 1～100 mg/L의 범위가 되도록 적당한 농도로 희석한다.

5) sodium-1-hexane sulfonate : 이온쌍 크로마토그래피용

6) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액의 조제

균질화한 검체 1 g을 정확히 달아 50 mL 용량의 메스플라스크에 넣고 물 15 mL를 가하여 습윤화한다. 메스플라스크에 메탄올 25 mL를 가하여 10분간 초음파 추출한 후 메탄올로 눈금을 채우고 0.45 ㎛ 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 사용한다. 단, 시험용액의 농도가 검량곡선의 농도범위를 벗어날 경우 농도 범위내로 희석하여 사용한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프의 측정조건

가) 컬럼 : C18 (4.6 mm × 250 mm, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

나) 컬럼온도 : 40℃

다) 이동상

(1) 이동상 A : 0.5 mM sodium-1-hexane sulfonate를 함유한 0.1% 인산 용액

(2) 이동상 B : 95% 아세토니트릴

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0	85	15
6	85	15
15	70	30
30	60	40
32	60	40
42	0	100
50	0	100
52	85	15
60	85	15

라) 이동상 유량 : 1.2 mL/min

마) UV 검출기파장 : 291 nm

바) PDA 검출기파장 : 200～400 nm

2) 검량선의 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

3) 표준품의 크로마토그램 및 스펙트럼

(a) 카스카로사이드 A, B, C, D의 크로마토그램

(b) 카스카로사이드 A, B의 스펙트럼

(C) 카스카로사이드 C, D의 스펙트럼

4) 정량한계 : 25 mg/kg

사. 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피크는 동일한 측정조건에서 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치하여야 하며 PDA 검출기에서 표준용액과 시험용액이 동일한 스펙트럼을 보여야 한다.

아. 정량시험

정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 시험결과를 피크 높이법 또는 피크 면적법에 따라 정량한다.

1) 계산방법

검량곡선에서 얻어진 표준물질의 피크 높이 또는 피크 면적을 Y축으로 하고 표준물질의 농도를 X축으로 하여 검량곡선을 작성하고 시험용액의 높이 또는 면적을 Y축에 대입하여 카스카로사이드의 농도를 계산한다.

시료 중 함량(mg/g) = C ×	V	× D
	S

C : 검량곡선에서 계산된 카스카로사이드의 농도 (mg/L)

V : 시험용액의 최종 부피 (L)

S : 검체 채취량 (g)

D : 희석배수

자. 확인시험

액체크로마토그래프/질량분석기로 분석하였을 때 시험용액 중 표준물질의 m/z 값은 표준용액 중 표준물질의 m/z 값과 일치하여야 한다.

1) 액체크로마토그래프/질량분석기의 측정조건

가) 컬럼 : C18 (2.0 mm × 100 mm, 3 ㎛) 또는 이와 동등한 것

나) 컬럼온도 : 40℃

다) 이동상

(1) 이동상 A : 0.1% formic acid를 함유한 물

(2) 이동상 B : 0.1% formic acid를 함유한 아세토니트릴

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0	95	5
3	95	5
18	20	80
18.1	0	100
20.9	0	100
21	95	5
25	95	5

라) 이동상 유량 : 0.3 mL/min

마) 이온화 방법 : ESI

바) capillary temperature : 340℃

사) spray voltage : 4.0 kV

아) MRM transition

물질	분자량	Ion mode	Precursor ion (m/z)	Fragment ion (m/z)
카스카로사이드 A (C27H32O14)	580.1	Negative	579	297, 459
카스카로사이드 B (C27H32O14)	580.1	Negative	579	297, 459
카스카로사이드 C (C27H32O13)	563.8	Negative	563	281, 443
카스카로사이드 D (C27H32O13)	563.8	Negative	563	281, 443

10.7.6 센노사이드(sennoside A, B)

가. 시험법의 적용범위

모든 식품에 적용한다.

나. 분석원리

균질화한 검체를 취하여 액-액 추출하고 액체크로마토그래프/ 자외부흡광검출기(UV photometric detector), PDA 검출기로 분석한다.

다. 장치

1) 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기(LC/UV photometric detector), PDA 검출기(LC/PDA), 액체크로마토그래프/질량분석기(LC/MS)를 사용한다.

라. 시약 및 시액

1) 유기용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

2) 물 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액 : 센노사이드 A(sennodise A), 센노사이드 B(sennodise B) 각각의 표준품을 아세토나이트릴/물 혼합액 (80/20, v/v)에 녹여 각각 1,000 mg/L이 되게 한다.

4) 표준용액 : 표준원액을 각각 메탄올에 녹여 1～100 mg/L이 되도록 적당한 농도로 희석한다.

5) sodium-1-hexane sulfonate : 이온쌍 크로마토그래피용

6) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액의 조제

균질화한 검체 1 g을 정확히 달아 50 mL 용량의 메스플라스크에 넣고 물 15 mL를 가하여 습윤화한다. 메스플라스크에 메탄올 25 mL를 가하여 10분간 초음파 추출한 후 메탄올로 눈금을 채우고 0.45 ㎛ 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 사용한다. 단, 시험용액의 농도가 검량곡선의 농도범위를 벗어날 경우 농도 범위내로 희석하여 사용한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프의 측정조건

가) 컬럼 : C18 (4.6 mm × 250 mm, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

나) 컬럼온도 : 40℃

다) 이동상

(1) 이동상 A : 0.5 mM sodium-1-hexane sulfonate를 함유한 0.1% 인산 용액

(2) 이동상 B : 95% 아세토니트릴

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0	85	15
6	85	15
15	70	30
30	60	40
32	60	40
42	0	100
50	0	100
52	85	15
60	85	15

라) 이동상 유량 : 1.2 mL/min

마) UV 검출기파장 : 220 nm

바) PDA 검출기파장 : 200～400 nm

2) 검량선의 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

3) 표준품의 크로마토그램 및 스펙트럼

(a) 센노사이드 A, B의 크로마토그램

(b) 센노사이드 A의 스펙트럼

(b) 센노사이드 B의 스펙트럼

4) 정량한계 : 25 mg/kg

사. 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피크는 동일한 측정조건에서 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치하여야 하며 PDA 검출기에서 표준용액과 시험용액이 동일한 스펙트럼을 보여야 한다.

아. 정량시험

정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 시험결과를 피크 높이법 또는 피크 면적법에 따라 정량한다.

1) 계산방법

검량곡선에서 얻어진 표준물질의 피크 높이 또는 피크 면적을 Y축으로 하고 표준물질의 농도를 X축으로 하여 검량곡선을 작성하고 시험용액의 높이 또는 면적을 Y축에 대입하여 센노사이드 A 및 B의 농도를 계산한다.

시료 중 함량(mg/g) = C ×	V	× D
	S

C : 검량곡선에서 계산된 센노사이드 A 및 B의 농도 (mg/L)

V : 시험용액의 최종 부피 (L)

S : 검체 채취량 (g)

D : 희석배수

자. 확인시험

액체크로마토그래프/질량분석기로 분석하였을 때 시험용액 중 표준물질의 m/z 값은 표준용액 중 표준물질의 m/z 값과 일치하여야 한다.

1) 액체크로마토그래프/질량분석기의 측정조건

가) 컬럼 : C18 (2.0 mm × 100 mm, 3 ㎛) 또는 이와 동등한 것

나) 컬럼온도 : 40℃

다) 이동상

(1) 이동상 A : 0.1% formic acid를 함유한 물

(2) 이동상 B : 0.1% formic acid를 함유한 아세토니트릴

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0	95	5
3	95	5
18	20	80
18.1	0	100
20.9	0	100
21	95	5
25	95	5

라) 이동상 유량 : 0.3 mL/min

마) 이온화 방법 : ESI

바) capillary temperature : 340℃

사) spray voltage : 4.0 kV

아) MRM transition

물질	분자량	Ion mode	Precursor ion (m/z)	Fragment ion (m/z)
센노사이드 A (C42H38O20)	862.7	Negative	861	224, 386, 699
센노사이드 B (C42H38O20)	862.7	Negative	861	224, 386, 699

[별표 1] 2. 중 377을 삭제하고 기존의 378∼491을 각각 377∼490으로, 492를 삭제하고 기존의 493∼660을 각각 491∼658로 하며, 661을 삭제하고 기존의 662∼952를 각각 659∼949로 한다.

[별표 3], (1) 이미녹타딘(Iminoctadine) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제하고, “마늘 0.5”를 “마늘 0.1”로 하며, “파 1.0”을 “파 0.5”로 한다.

[별표 3], (5) 노르플루라존(Norflurazon) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (9) 델타메트린(Deltamethrin) 중 “기타농산물 0.01”을 삭제한다.

[별표 3], (11) 멥틸디노캅(Meptyldinocap) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제하고, “감 0.5”를 “감 0.3”으로 하며, “오이 1.0”을 “오이 0.7”로 한다.

[별표 3], (12) 디디티(DDT) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (15) 디설포톤(Disulfoton) 중 “기타농산물 0.02”를 삭제한다.

[별표 3], (18) 디캄바(Dicamba) 중 “수수 3.0”을 “수수 0.1”로 한다.

[별표 3], (21) 디클로르보스(Dichlorvos) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제하고, “사과 2.0”을 “사과 0.05”로 하며, “오이 1.0”을 “오이 0.1”로 하고, “파 0.5”를 “파 0.1”로 한다.

[별표 3], (26) 디페노코나졸(Difenoconazole) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (28) 디펜아미드(Diphenamid) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (29) 디플루벤주론(Diflubenzuron) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (37) 메카밤(Mecarbam) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (46) 메틸브로마이드(Methylbromide) 중 “기타농산물 20”을 삭제한다.

[별표 3], (48) 바미도티온(Vamidothion) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (50) 베나락실(Benalaxyl) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (52) 벤디오카브(Bendiocarb) 중 “기타농산물 0.02”를 삭제한다.

[별표 3], (55) 뷰프로페진(Buprofezin) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (58) 비에치시(BHC) 중 “기타농산물 0.01”을 삭제한다.

[별표 3], (61) 비펜트린(Bifenthrin) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (63) 세톡시딤(Sethoxydim) 중 “아몬드 1.0”, “피칸 1.0”을 삭제하고, “견과류 1.0”을 “견과류 0.05†”로 하며, “면실 5.0”을 “면실 0.05†”로 하며, “아보카도 1.0”을 “아보카도 0.04†”로 하고, “해바라기씨 7.0”을 “해바라기씨 0.05†”로 한다.

[별표 3], (65) 사이로마진(Cyromazine) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제하고, “느타리버섯 5.0”을 “느타리버섯 3.0”으로 하며, “수박 0.3”을 “수박 0.1”로 한다.

[별표 3], (68) 사이할로트린(Cyhalothrin) 중 “복숭아 0.5”를 “복숭아 0.2”로 한다.

[별표 3], (71) 아미트라즈(Amitraz) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (76) 알드린 및 디엘드린(Aldrin & Dieldrin) 중 “기타농산물 0.01”을 삭제한다.

[별표 3], (77) 알디카브(Aldicarb) 중 “기타농산물 0.02”를 삭제한다.

[별표 3], (83) 에티온(Ethion) 중 “기타농산물 0.01”을 삭제한다.

[별표 3], (85) 에토펜프록스(Etofenprox) 중 “기타농산물 0.01”을 삭제한다.

[별표 3], (88) 에트림포스(Etrimfos) 중 “기타농산물 0.01”을 삭제한다.

[별표 3], (90) 엔도설판(Endosulfan) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (91) 엔드린(Endrin) 중 “기타농산물 0.01”을 삭제한다.

[별표 3], (101) 이미다클로프리드(Imidacloprid) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (106) 이피엔(EPN) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (107) 키노메티오네이트(Chinomethionat) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (108) 티오메톤(Thiometon) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (110) 카두사포스(Cadusafos) 중 “기타농산물 0.01”을 삭제한다.

[별표 3], (112) 카벤다짐(Carbendazim) 중 “기타농산물 0.01”을 삭제한다.

[별표 3], (113) 카보페노티온(Carbophenothion) 중 “기타농산물 0.02”를 삭제한다.

[별표 3], (114) 카보퓨란(Carbofuran) 중 “바나나 0.1”을 “바나나 0.01†”로 한다.

[별표 3], (116) 카탑(Cartap) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (117) 캡타폴(Captafol) 중 “기타농산물 0.02”를 삭제한다.

[별표 3], (120) 퀸토젠(Quintozene) 중 “기타농산물 0.01”을 삭제한다.

[별표 3], (124) 클로로벤질레이트(Chlorobenzilate) 중 “기타농산물 0.02”를 삭제한다.

[별표 3], (125) 클로로탈로닐(Chlorothalonil) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (129) 클로르펜빈포스(Chlorfenvinphos) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (130) 클로르프로팜(Chlorpropham) 중 “감자 50.0”을 “감자 20”으로 한다.

[별표 3], (132) 클로르피리포스-메틸(Chlorpyrifos-methyl) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (134) 터부트린(Terbutryn) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (135) 터부포스(Terbufos) 중 “기타농산물 0.01”을 삭제한다.

[별표 3], (149) 트리플루미졸(Triflumizole) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (164) 펜발러레이트(Fenvalerate) 중 “아몬드 0.2”, “호두 0.2”를 삭제하고, 다음 항목을 신설한다.

견과류	0.15†

[별표 3], (173) 포레이트(Phorate) 중 “감자 0.2”를 “감자 0.05”로 하고, “마늘 0.1”을 “마늘 0.05”로 한다.

[별표 3], (176) 포스멧(Phosmet, PMP) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (180) 플루실라졸(Flusilazole) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (181) 플루발리네이트(Fluvalinate) 중 “기타농산물 0.01”을 삭제한다.

[별표 3], (182) 플루시트리네이트(Flucythrinate) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (184) 프로메트린(Prometryn) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (185) 프로사이미돈(Procymidone) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (186) 프로클로라즈(Prochloraz) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (188) 프로파모카브(Propamocarb) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (191) 프로폭서(Propoxur) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (192) 프로피코나졸(Propiconazole) 중 “옥수수 1.0”을 “옥수수 0.05”로 한다.

[별표 3], (198) 피페로닐부톡사이드(Piperonyl butoxide) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (202) 헵타클로르(Heptachlor) 중 “기타농산물 0.01”을 삭제한다.

[별표 3], (207) 테부페노자이드(Tebufenozide) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (220) 디에토펜카브(Diethofencarb) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (222) 메파니피림(Mepanipyrim) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (228) 아족시스트로빈(Azoxystrobin) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (229) 카프로파마이드(Carpropamide) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (232) 트리사이클라졸(Tricyclazole) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (233) 펜사이큐론(Pencycuron) 중 “기타농산물 0.1”를 삭제한다.

[별표 3], (234) 펜피록시메이트(Fenpyroximate) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (238) 플루디옥소닐(Fludioxonil) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (259) 피리메타닐(Pyrimethanil) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (291) 족사마이드(Zoxamide) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (294) 터부틸라진(Terbuthylazine) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (309) 플루톨라닐(Flutolanil) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (325) 사이아조파미드(Cyazofamid) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (327) 오리사스트로빈(Orysastrobin) 중 “기타농산물 0.07”을 삭제한다.

[별표 3], (362) 트리아자메이트(Triazamate) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (370) 벤티아발리카브아이소프로필(Benthiavalicarb-isopropyl) 중 “기타농산물 0.07”을 삭제한다.

[별표 3], (371) 디니코나졸(Diniconazole) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (373) 스피로메시펜(Spiromesifen) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (374) 알라니카브(Alanycarb) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (375) 오퓨레이스(Ofurace) 중 “기타농산물 0.02”를 삭제한다.

[별표 3], (376) 트리플루뮤론(Triflumuron) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (377) 티펜설퓨론메틸(Thifensulfuron-methyl) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (378) 페림존(Ferimzone) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (379) 플루아크리피림(Fluacrypyrim) 중 “기타농산물 0.1”을 삭제한다.

[별표 3], (380) 피리달릴(Pyridalyl) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (384) 사이플루페나미드(Cyflufenamid) 중 “기타농산물 0.1”을 삭제한다.

[별표 3], (386) 플로니카미드(Flonicamid) 중 “기타농산물 0.1”을 삭제한다.

[별표 3], (390) 시메코나졸(Simeconazole) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (391) 만디프로파미드(Mandipropamid) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (393) 메트알데하이드(Metaldehyde) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (394) 비스트리플루론(Bistrifluron) 중 “기타농산물 0.2”를 삭제한다.

[별표 3], (395) 플루오피콜라이드(Fluopicolide) 중 “기타농산물 0.1”을 삭제한다.

[별표 3], (396) 에티클로제이트(Ethychlozate) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (399) 사이플루메토펜(Cyflumetofen) 중 “기타농산물 0.07”을 삭제한다.

[별표 3], (401) 디비이디시(DBEDC) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (403) 메타플루미존(Metaflumizone) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (404) 메트라페논(Metrafenone) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (405) 사이에노피라펜(Cyenopyrafen) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (408) 스피네토람(Spinetoram) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (409) 아미설브롬(Amisulbrom) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (410) 옥솔린산(Oxolinic acid) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (415) 크로마페노자이드(Chromafenozide) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (416) 클로란트라닐리프롤(Chlorantraniliprole) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (417) 플루벤디아마이드(Flubendiamide) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (419) 프로헥사디온-칼슘(Prohexadione-calcium) 중 “기타농산물 0.05”를 삭제한다.

[별표 3], (420) 린단(Lindane, γ-BHC) 중 “기타농산물 0.01”을 삭제한다.

부칙

제1조(시행일) ① 이 고시는 고시한 날부터 시행한다.

② 제1조제1항에도 불구하고 다음 각 호의 구분에 따른 개정규정은 다음 각 호에서 정한 날부터 시행한다.

1. 시행일 : 고시 후 2개월이 경과한 날

가. 별표3(다만, 기타농산물의 개정 규정 제외)

2. 시행일 : 고시 후 6개월이 경과한 날

가. 제2. 3. 5) (2) 중금속

나. 제2. 3. 16) (1) 히스타민

3. 시행일 : 고시 후 1년이 경과한 날

가. 제4. 7. 식용유지류

4. 시행일 : 2019년 1월 1일

가. 제2. 3. 4) (2) 바

나. 제5. 2. 1) (2)

다. 제7. 4.26∼4.31

라. 제2. 3. 7)

마. 별표3 중 “기타농산물” 개정 규정

제2조(적용례) 이 고시는 이 고시 시행 이후 최초로 제조·가공 또는 수입한 식품(선적일 기준)부터 적용한다.

제3조(경과조치) 이 고시는 이 고시 시행 당시 제조․가공․판매 또는 수입되어 검사가 진행 중인 사항에 대하여는 종전의 규정에 따른다.

신․ 구조문 대비표

현  행

개  정(안)

제1. 총칙

1. (생   략)

2. 기준 및 규격의 적용

1) ～ 3) (생   략)

4) 가공식품에 대한 중금속, 곰팡이독소, 패독소 등 오염물질 기준은 원료 식품의 기준 범위 내에서 적용 할 수 있다. 즉, 원료의 함량에 따라 원료 농․임․축․수산물의 기준을 적용하고, 건조 등의 과정으로 인하여 수분 함량이 변화된 경우는 수분 함량을 고려하여 적용한다.

5) ～ 12) (생   략)

제2. 식품일반에 대한 공통기준 및 규격

1. ∼ 2. (생   략)

3. 식품일반의 기준 및 규격

1) ∼ 3) (생  략)

4) 위생지표균 및 식중독균

(1) (생  략)

(2) 식중독균

가. ∼ 마. (생  략)

바. 식품접객업소 등의 노로바이러스 기준

식품접객업소, 집단급식소, 식품제조․가공업소 등에서 식재료 및 식기 등의 세척, 식품의 조리 및 제조․가공, 먹는 물 등으로 사용하는 물 : 불검출(다만, 식품접객업소, 집단급식소 등에서 먹는 물로 제공되는 수돗물은 먹는물관리법에서 규정하고 있는 먹는물 수질기준에 의한다)

5) 오염물질

<신    설>

(1) 중금속 기준

① 농산물

대상식품		납 (㎎/㎏)	카드뮴 (㎎/㎏)	무기비소 (㎎/㎏)
곡류(현미 제외)		(생략)	(생략)	(생략)
서류		(생략)	(생략)	-
콩류		(생략)	(생략)	-
견과 종실류	땅콩 또는 견과류	(생략)	(생략)	-
	유지 종실류	0.3 이하 (참깨에 한한다)	(생략)	-
과일류		0.1 이하 (사과, 귤, 장과류는 0.2 이하)	(생략)	-
엽채류(결구 엽채류 포함)		(생략)	(생략)	-
엽경채류		(생략)	(생략)	-
근채류		0.1 이하 (인삼, 산양삼, 도라지, 더덕 2.0 이하)	0.1 이하 (양파 0.05 이하, 인삼, 산양삼, 도라지, 더덕 0.2 이하)	-
과채류		(생략)	(생략)	-
버섯류		(생략)	(생략)	-
*(생 략)

② (생   략)

③ 수산물

대상식품	납(mg/kg)	카드뮴(mg/kg)	수은(mg/kg)	메틸수은(mg/kg)
어류	(생략)	0.1 이하 (민물 및 회유 어류에 해당된다) 0.2 이하 (해양어류에 해당된다)	(생략)	1.0 이하 (심해성 어류, 다랑어류 및 새치류에 해당된다)
연체류	2.0 이하 (다만, 내장을 포함한 낙지는 2.0 이하)	2.0 이하 (다만, 내장을 포함한 낙지는 3.0 이하)	(생략)	-
갑각류	1.0 이하 [다만, 내장을 포함한 꽃게류 (꽃게과에 속하는 꽃게 종)는 2.0 이하]	1.0 이하 [다만, 내장을 포함한 꽃게류 (꽃게과에 속하는 꽃게 종)는 5.0 이하]	-	-
해조류	<신 설>	0.3 이하 [김(조미김을 포함하며, 생물 기준 적용)에 해당된다]	-	-
냉동식용 어류머리	(생략)	(생략)	(생략)	(생략)
냉동식용어류내장	(생략)	(생략)	(생략)	(생략)

④ ～ ⑤ (생   략)

⑥ 건조 농․임․축․수산물 등의 중금속 기준은 건조과정으로 인하여 수분함량이 변화된 경우에는 수분함량을 고려하여 적용하여야 한다.

(2) ～ (7) (생   략)

(8) 패독소 기준

① ～ ② (생   략)

③ 건조 수산물의 패독소 잠정 기준 적용

건조 과정으로 인하여 수분함량이 변화된 경우는 수분함량을 고려하여 적용한다.

(9) (생   략)

6) (생  략)

7) 농약의 잔류허용기준

(1) 농산물의 잔류농약 기준적용

① 농산물에 잔류한 농약에 대하여 「식품의 기준 및 규격」에 별도로 잔류허용기준을 정하지 않은 경우 다음 각 항의 기준을 순차적으로 적용한다. (단, 제1. 4. 1) 식물성 원료의 분류에서 견과종실류 및 과일류 중 열대과일류의 경우에는 제외)

㉮ 당해 농산물(개별 농산물 그 자체를 의미하며 그룹으로 설정된 농산물은 제외)에 대한 CODEX 기준

㉯ [별표 3] 농산물의 농약 잔류허용기준의 그 농약 기준 중 당해농산물과 제1. 4. 1) 식물성 원료의 분류에서 정한 동일 대분류군(단, 소분류가 있을 경우 소분류를 우선 적용)에 속한 농산물의 최저기준

② 제1. 4. 1) 식물성 원료의 분류에서 견과종실류 및 과일류 중 열대과일류에 잔류한 농약에 대하여 「식품의 기준 및 규격」에 별도로 잔류허용기준을 정하지 않은 경우 0.01 mg/kg을 적용한다.

③ 상기 “①”의 규정에 해당되지 않은 농약의 경우에는 [별표 3] 농산물의 농약 잔류허용기준의 그 농약 기준 중 최저기준을 적용한다(단, 해당 농약의 기준 중 기타 농산물의 기준이 있을 경우에는 기타 농산물의 기준을 우선적으로 적용한다.)

(2) 농산물의 농약 잔류허용기준

① 농산물의 농약 잔류허용기준은 [별표 3]과 같다. 단, 개별 기준과 그룹 기준이 있을 경우에는 개별 기준을 우선 적용한다.

② 「농약관리법」상 사용․등록된  농약 및 외국에서 해당 국가의 법률에 따라 합법적으로 사용되는 농약에 함유된 유효성분 중 아래의 성분에 대하여는 잔류허용기준 설정을 면제한다.

번호	유효성분
1	1-메틸사이클로프로펜(1-Methylcyclopropene)
2	기계유(Machine oil)
3	데실알코올(Decylalcohol)
4	모나크로스포륨타우마슘케이비시3017(Monacrosporium thaumasium KBC3017)
5	바실루스서브틸리스디비비1501(Bacillus subtilis DBB1501)
6	바실루스서브틸리스시제이-9(Bacillus subtilis CJ-9)
7	바실루스서브틸리스엠 27(Bacillus subtilis M 27)
8	바실루스서브틸리스엠비아이600(Bacillus subtilis MBI600)
9	바실루스서브틸리스와이1336(Bacillus subtilis Y1336)
10	바실루스서브틸리스이더블유42-1(Bacillus subtilis EW42-1)
11	바실루스서브틸리스제이케이케이238(Bacillus subtilis JKK238)
12	바실루스서브틸리스지비365(Bacillus subtilis GB0365)
13	바실루스서브틸리스케이비401(Bacillus subtilis KB401)
14	바실루스서브틸리스케이비시1010(Bacillus subtilis KBC1010)
15	바실루스서브틸리스큐에스티713(Bacillus subtilis QST713)
16	바실루스아밀로리퀴파시엔스케이비시1121(Bacillus amyloliquefaciens KBC1121)
17	바실루스푸밀루스큐에스티2808(Bacillus pumilus QST2808)
18	보르도혼합액(Bordeaux mixture)
19	뷰베리아바시아나지에이치에이(Beauveria bassiana GHA)
20	뷰베리아바시아나티비아이-1(Beauveria bassiana TBI-1)
21	비티아이자와이(Bacillus thuringiensis subsp. aizawai)
22	비티아이자와이엔티423(Bacillus thuringiensis subsp. aizawai NT0423)
23	비티아이자와이지비413(Bacillus thuringiensis subsp. aizawai GB413)
24	비티쿠르스타키(Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki)
25	비티쿠르스타키(Bacillus thuringiensis var. kurstaki)
26	석회황(Calcium polysulfide, lime sulfur)
27	스트렙토마이세스고시키엔시스더블유와이이324(Streptomyces goshikiensis WYE324)
28	스트렙토마이세스콜롬비엔시스더블유와이이20(Streptomyces colombiensis WYE20)
29	스프레더스티커(Spreader sticker)
30	폴리에틸렌메틸실록세인(Polyethylene Methyl Siloxane)
31	아이비에이(IBA, 4-indol-3-ylbutyric acid)
32	아이에이에이(IAA, Indol-3-ylacetic acid)
33	알킬설폰화알킬레이트의나트륨염(Sodium salt of alkylsulfonated alkylate)
34	알킬아릴폴리에톡시레이트(Alkyl aryl polyethoxylate)
35	암펠로마이세스퀴스콸리스에이큐94013(Ampelomyces quisqualis AQ94013)
36	옥시에틸렌메틸실록세인(Oxyethylene methyl siloxane)
37	지베렐린류(Gibberellin A3, Gibberellin A4+7)
38	칼슘카보네이트(Calcium carbonate)
39	코퍼설페이트베이식(Copper sulfate basic)
40	코퍼설페이트트리베이식(Copper sulfate tribasic)
41	코퍼옥시클로라이드(Copper oxychloride)
42	코퍼하이드록사이드(Copper hydroxide)
43	트리코델마하지아늄와이씨 459(Trichoderma harzianum YC 459)
44	패니바실루스폴리믹사에이시-1(Paenibacillus polymyxa AC-1)
45	패실로마이세스퓨모소로세우스디비비-2032(Paecilomyces fumosoroseus DBB-2032)
46	폴리나프틸메탄설폰산디알킬디메틸암모니움염(Polynaphthyl methane sulfonic acid dialkyl dimethyl ammonium(PMSAADA))
47	폴리에테르폴리실록세인(Polyether modified polysiloxane)
48	폴리옥시에틸렌메틸폴리실록세인(Polyoxyethylene methyl Polysiloxane)
49	폴리옥시에틸렌알킬아릴에테르(Polyoxyethylene alkylarylether)
50	폴리옥시에틸렌지방산에스테르(Polyoxyethylene fatty acid ester(PFAE))
51	황(Sulfur)
52	니즈(polynaphtyl methane sulfonic + polyoxyethylene fatty acid ester)
53	소듐리그노설포네이트(Sodium ligno sulfonate)
54	심플리실리움라멜리콜라비씨피(Simplicillium lamellicola BCP)
55	트리코더마아트로비라이드에스케이티-1(Trichoderma atroviride SKT-1)
56	파라핀, 파라핀오일(Paraffin, Paraffinic oil)
57	펠라르곤산(Pelargonic acid)
58	에틸포메이트(Ethyl formate)

(3) (생   략)

(4) 가공식품의 잔류농약 잠정기준적용

가공식품에 잔류한 농약에 대하여 「식품의 기준 및 규격」에 별도로 잔류허용기준을 정하지 않은 경우 다음 각 항의 기준을 순차적으로 적용한다.

① CODEX 기준을 우선 적용

② (생   략)

(5) ∼ (6) (생   략)

8) (생   략)

9) 부정물질

(1) (생   략)

① 발기부전치료제 및 그 유사물질

번호	물질명
1～50	(생 략)
<신 설>
<신 설>

② ～ ③ (생   략)

④ 기타 의약품 성분

번호	물질명
1	리오치로닌(T3)
2	레보치록신(T4)
3	에페드린(ephedrine)
4	플루옥세틴(fluoxetine)
5	펜플루라민(fenfluramine)
6	N-니트로소펜플루라민 (N-nitrosofenfluramine)
<신 설>
<신 설>
<신 설>
<신 설>
<신 설>

10) ～ 15) (생   략)

16) 수산물에 대한 규격

(1) 히스타민 : 냉동어류, 염장어류, 통조림, 건조 또는 절단 등 단순 처리한 것(어육, 필렛, 건멸치 등) : 200 mg/kg 이하(고등어, 다랑어류, 연어, 꽁치, 청어, 멸치, 삼치, 정어리, 몽치다래, 물치다래에 한한다)

(2) ～ (3) (생   략)

17) (생   략)

4. (생   략)

제3. 장기보존식품의 기준 및 규격

(생   략)

제1. 총칙

1. (현행과 같음)

2. 기준 및 규격의 적용

1) ～ 3) (현행과 같음)

<삭    제>

4) ～ 11) (현행과 같음)

제2. 식품일반에 대한 공통기준 및 규격

1. ∼ 2. (현행과 같음)

3. 식품일반의 기준 및 규격

1) ∼ 3) (현행과 같음)

4) 위생지표균 및 식중독균

(1) (현행과 같음)

(2) 식중독균

가. ∼ 마. (현행과 같음)

바. -------------- 식중독 바이러스 -----

----------------------

----------------------

----------------------

----------------------

---------------------물에서는 노로바이러스, A형·E형 간염바이러스, 로타바이러스, 아스트로바이러스, 장관아데노바이러스, 사포바이러스가 검출되어서는 아니 된다(단, 수돗물 및 염소 등으로 소독한 식품용수는 제외한다).

5) 오염물질

(1) 오염물질 기준 적용

① 건조 과정으로 인하여 수분함량이 변화된 건조 농․임․축․수산물의 중금속, 패독소, 폴리염화비페닐(PCBs) 기준은 수분함량의 변화를 고려하여 생물 기준으로 환산‧적용한다.

② 그대로 섭취하지 않는 건조 농․임․축․수산물의 방사능 기준은 수분함량의 변화를 고려하여 생물 기준으로 환산‧적용한다.

③ 기준이 별도로 설정되어 있지 않은 가공식품의 중금속, 곰팡이독소, 패독소 등 오염물질 기준은 원료의 함량에 따라 해당 농․임․축․수산물의 기준을 적용하고, 건조 등의 과정으로 인하여 수분 함량이 변화된 경우는 수분 함량을 고려하여 적용한다.

④ 기준이 설정되어 있는 가공식품 중 희석하여 섭취하는 식품의 중금속, 방사능, 다이옥신, 폴리염화비페닐(PCBs) 기준은 섭취시의 상태(제조사가 제시한 섭취방법)를 반영하여 적용한다.

(2) 중금속 기준

① 농산물

대상식품		납 (㎎/㎏)	카드뮴 (㎎/㎏)	무기비소 (㎎/㎏)
곡류(현미 제외)		(현행과 같음)	(현행과 같음)	(현행과 같음)
서류		(현행과 같음)	(현행과 같음)	-
콩류		(현행과 같음)	(현행과 같음)	-
견과 종실류	땅콩 또는 견과류	(현행과 같음)	(현행과 같음)	-
	유지 종실류	0.3 이하 (참깨, 들깨에 한한다)	(현행과 같음)	-
과일류		0.1 이하	(현행과 같음)	-
엽채류(결구 엽채류 포함)		(현행과 같음)	(현행과 같음)	-
엽경채류		(현행과 같음)	(현행과 같음)	-
근채류		0.1 이하 (인삼, 산양삼은 2.0 이하, 도라지, 더덕은 0.2 이하)	0.1 이하 (양파는 0.05 이하, 인삼, 산양삼은 0.2 이하)	-
과채류		(현행과 같음)	(현행과 같음)	-
버섯류		(현행과 같음)	(현행과 같음)	-
*(현행과 같음)

② (현행과 같음)

③ 수산물

대상식품	납(mg/kg)	카드뮴(mg/kg)	수은(mg/kg)	메틸수은(mg/kg)
어류	(현행과 같음)	0.1 이하 (민물 및 회유 어류에 한한다) 0.2 이하 (해양어류에 한한다)	(현행과 같음)	1.0 이하 (심해성 어류, 다랑어류 및 새치류에 한한다)
연체류	2.0 이하 (다만, 내장을 포함한 낙지는 2.0 이하, 오징어는 1.0 이하)	2.0 이하 (다만, 내장을 포함한 낙지는 3.0 이하, 오징어는 1.5 이하)	(현행과 같음)	-
갑각류	0.5 이하 (다만, 내장을 포함한 꽃게류는 2.0 이하)	1.0 이하 (다만, 내장을 포함한 꽃게류는 5.0 이하)	-	-
해조류	0.5 이하 (미역에 한한다)	0.3 이하 [김(조미김 포함)에 한한다] 0.1 이하 (미역에 한한다)	-	-
냉동식용 어류머리	(현행과 같음)	(현행과 같음)	(현행과 같음)	(현행과 같음)
냉동식용어류내장	(현행과 같음)	(현행과 같음)	(현행과 같음)	(현행과 같음)

④ ～ ⑤ (현행과 같음)

<삭    제>

(3) ～ (8)

(9) 패독소 기준

① ～ ② (현행과 같음)

<삭    제>

(10) (현행과 같음)

6) (현행과 같음)

7) 농약의 잔류허용기준

(1) 농산물의 농약 잔류허용기준

① 농산물의 농약 잔류허용기준은 [별표 3]과 같다. 단, 개별 기준과 그룹 기준이 있을 경우에는 개별 기준을 우선 적용한다.

② 농산물에 잔류한 농약에 대하여 [별표 3]에 별도로 잔류허용기준을 정하지 않는 경우 0.01 mg/kg이하를 적용한다.

③ 「농약관리법」상 사용․등록된  농약 및 외국에서 해당 국가의 법률에 따라 합법적으로 사용되는 농약에 함유된 유효성분 중 아래의 사유에 해당되는 경우 잔류허용기준을 면제할 수 있으며, 면제 대상성분은 아래 표와 같다.

㉮ 독성이 현저히 낮아 인체 위해가능성이 없는 성분

㉯ 식품에 전혀 잔류되지 않는 성분

㉰ 자연계에 존재하여 해당 식품에 포함되어 있으므로 구분이 어려운 성분

㉱ 안전성이 확보된 천연식물보호제(미생물 등 포함) 성분

번호	유효성분
1	1-메틸사이클로프로펜(1-Methylcyclopropene)
2	기계유(Machine oil)
3	데실알코올(Decylalcohol)
4	모나크로스포륨타우마슘케이비시3017(Monacrosporium thaumasium KBC3017)
5	바실루스서브틸리스디비비1501(Bacillus subtilis DBB1501)
6	바실루스서브틸리스시제이-9(Bacillus subtilis CJ-9)
7	바실루스서브틸리스엠 27(Bacillus subtilis M 27)
8	바실루스서브틸리스엠비아이600(Bacillus subtilis MBI600)
9	바실루스서브틸리스와이1336(Bacillus subtilis Y1336)
10	바실루스서브틸리스이더블유42-1(Bacillus subtilis EW42-1)
11	바실루스서브틸리스제이케이케이238(Bacillus subtilis JKK238)
12	바실루스서브틸리스지비365(Bacillus subtilis GB0365)
13	바실루스서브틸리스케이비401(Bacillus subtilis KB401)
14	바실루스서브틸리스케이비시1010(Bacillus subtilis KBC1010)
15	바실루스서브틸리스큐에스티713(Bacillus subtilis QST713)
16	바실루스아밀로리퀴파시엔스케이비시1121(Bacillus amyloliquefaciens KBC1121)
17	바실루스푸밀루스큐에스티2808(Bacillus pumilus QST2808)
18	보르도혼합액(Bordeaux mixture)
19	뷰베리아바시아나지에이치에이(Beauveria bassiana GHA)
20	뷰베리아바시아나티비아이-1(Beauveria bassiana TBI-1)
21	비티아이자와이(Bacillus thuringiensis subsp. aizawai)
22	비티아이자와이엔티423(Bacillus thuringiensis subsp. aizawai NT0423)
23	비티아이자와이지비413(Bacillus thuringiensis subsp. aizawai GB413)
24	비티쿠르스타키(Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki)
25	비티쿠르스타키(Bacillus thuringiensis var. kurstaki)
26	석회황(Calcium polysulfide, lime sulfur)
27	스트렙토마이세스고시키엔시스더블유와이이324(Streptomyces goshikiensis WYE324)
28	스트렙토마이세스콜롬비엔시스더블유와이이20(Streptomyces colombiensis WYE20)
29	스프레더스티커(Spreader sticker)
30	폴리에틸렌메틸실록세인(Polyethylene Methyl Siloxane)
31	아이비에이(IBA, 4-indol-3-ylbutyric acid)
32	아이에이에이(IAA, Indol-3-ylacetic acid)
33	알킬설폰화알킬레이트의나트륨염(Sodium salt of alkylsulfonated alkylate)
34	알킬아릴폴리에톡시레이트(Alkyl aryl polyethoxylate)
35	암펠로마이세스퀴스콸리스에이큐94013(Ampelomyces quisqualis AQ94013)
36	옥시에틸렌메틸실록세인(Oxyethylene methyl siloxane)
37	지베렐린류(Gibberellin A3, Gibberellin A4+7)
38	칼슘카보네이트(Calcium carbonate)
39	코퍼설페이트베이식(Copper sulfate basic)
40	코퍼설페이트트리베이식(Copper sulfate tribasic)
41	코퍼옥시클로라이드(Copper oxychloride)
42	코퍼하이드록사이드(Copper hydroxide)
43	트리코델마하지아늄와이씨 459(Trichoderma harzianum YC 459)
44	패니바실루스폴리믹사에이시-1(Paenibacillus polymyxa AC-1)
45	패실로마이세스퓨모소로세우스디비비-2032(Paecilomyces fumosoroseus DBB-2032)
46	폴리나프틸메탄설폰산디알킬디메틸암모니움염(Polynaphthyl methane sulfonic acid dialkyl dimethyl ammonium(PMSAADA))
47	폴리에테르폴리실록세인(Polyether modified polysiloxane)
48	폴리옥시에틸렌메틸폴리실록세인(Polyoxyethylene methyl Polysiloxane)
49	폴리옥시에틸렌알킬아릴에테르(Polyoxyethylene alkylarylether)
50	폴리옥시에틸렌지방산에스테르(Polyoxyethylene fatty acid ester(PFAE))
51	황(Sulfur)
52	니즈(polynaphtyl methane sulfonic + polyoxyethylene fatty acid ester)
53	소듐리그노설포네이트(Sodium ligno sulfonate)
54	심플리실리움라멜리콜라비씨피(Simplicillium lamellicola BCP)
55	트리코더마아트로비라이드에스케이티-1(Trichoderma atroviride SKT-1)
56	파라핀, 파라핀오일(Paraffin, Paraffinic oil)
57	펠라르곤산(Pelargonic acid)
58	에틸포메이트(Ethyl formate)

<삭    제>

(2) (현행과 같음)

(3) 가공식품의 잔류농약 잠정기준적용

가공식품에 잔류한 농약에 대하여 [별표 3]에 별도로 잔류허용기준을 정하지 않은 경우 다음을 적용한다.

<삭    제>

① (현행과 같음)

(4) ∼ (5) (현행과 같음)

8) (현행과 같음)

9) 부정물질

(1) (현행과 같음)

① 발기부전치료제 및 그 유사물질

번호	물질명
1～50	(현행과 같음)
51	이소프로필노르타다라필 (Isopropylnortadalafil)
52	데스카본실데나필 (descarbonsildenafil)

② ～ ③ (현행과 같음)

④ 기타 의약품 성분

번호	물질명
1	리오치로닌(T3)
2	레보치록신(T4)
3	에페드린(ephedrine)
4	플루옥세틴(fluoxetine)
5	펜플루라민(fenfluramine)
6	N-니트로소펜플루라민 (N-nitrosofenfluramine)
7	페놀프탈레인(phenolphthaleine)
8	요힘빈(yohimbine)
9	이카린(icarine)
10	센노사이드(sennoside)
11	카스카로사이드(cascaroside)

10) ～ 15) (현행과 같음)

16) 수산물에 대한 규격

(1) 히스타민 : ------------ -------------------- ------------------------------------------   -----------------------------------몽치다래, 물치다래, 방어에 한한다)

(2) ～ (3) (현행과 같음)

17) (현행과 같음)

4. (현행과 같음)

제3. 장기보존식품의 기준 및 규격

(현행과 같음)

제4. 식품별 기준 및 규격

1. ～ 6. (생   략)

7. 식용유지류

(생   략)

7 -1 식물성유지류

1) 정의

식물성유지류라 함은 유지를 함유한 식물(파쇄분 포함)로부터 얻은 원료 유지를 식용에 적합하게 처리한 것이거나 이를 원료로 하여 제조․가공한 것으로 콩기름, 옥수수기름, 채종유, 미강유, 참기름, 추출참깨유, 들기름, 추출들깨유, 홍화유, 해바라기유, 목화씨기름, 땅콩기름, 올리브유, 팜유류, 야자유, 고추씨기름 등을 말한다.

2) (생   략)

3) 제조․가공기준

(1) ～ (3) (생   략)

(4) 압착 또는 이산화탄소(초임계추출)로 얻어진 참기름과 들기름에는 다른 식용유지를 일절 혼합하여서는 아니 된다.

(5) (생   략)

<신    설>

4) 식품유형

(1) ～ (4) (생   략)

(5) 참기름

참깨를 압착하여 얻은 압착참기름 또는 이산화탄소(초임계추출)로 추출한 초임계추출 참기름을 말한다.

(6) 추출참깨유

참깨로부터 추출한 원료유지를 정제한 것을 말한다.

(7) 들기름

들깨를 압착하여 얻은 압착들기름 또는 이산화탄소(초임계추출)로 추출한 초임계추출 들기름을 말한다.

(8) 추출들깨유

들깨로부터 추출한 원료유지를 정제한 것을 말한다.

(9) ～ (16) (생   략)

(17) 기타식물성유지

단일 식물성 원료로부터 채취한 원료유지를 식용에 적합하도록 처리한 것 또는 압착방법으로 착유하고 남은 박으로부터 채취한 원료유지를 식용에 적합하도록 정제 처리한 것을 말한다. 다만, 다른 기준 및 규격이 정하여져 있는 것은 그 기준․규격에 의한다.

5) 규격

(생   략)

유형 항목	참기름	추출참깨유	들기름	추출들깨유
(1)산가	4.0 이하	0.6 이하	5.0 이하	0.6 이하
(2)요오드가	103~118	103~118	160~209	160~209
(3)산화방지제 (g/kg)	-	-	다음에서 정하는 것 이외의 산화방지제가 검출되어서는 아니 된다.
			부틸히드록 시아니솔 디부틸히드 록시톨루엔 터셔리부틸 히드로퀴논	0.2 이하(병용할 때에는 부틸히드록시아니솔, 디부틸히드록시톨루엔 및 터셔리부틸히드로퀴논으로서의 사용량의 합계가 0.2 이하)
			몰식자산 프로필	0.1 이하
(4)리놀렌산 (%)*	0.5 이하	-	-	-
(5)에루스산 (%)	검출되어서는 아니 된다.	-	-	-

* 팔미트산(C16:0), 스테아르산(C18:0), 올레산(C18:1), 리놀레산(C18:2), 리놀렌산(C18:3), 아라키딘산(C20:0) 중 리놀렌산 함량

(생   략)

6) (생   략)

7-2 (생   략)

7-3 식용유지가공품

1) ∼ 2) (생   략)

3) 제조․가공기준

<신    설>

4) 식품유형

(1) 혼합식용유

이 고시에서 제품유형이 정하여진 2종 이상의 식용유지(다만, 압착한 참기름, 압착한 들기름, 향미유 제외)를 단순히 혼합한 것을 말한다.

(2) 향미유

식용유지(다만, 압착참기름, 초임계추출참기름, 압착들기름, 초임계추출들기름은 제외)에 향신료, 향료, 천연추출물, 조미료 등을 혼합한 것(식용유지 50% 이상)으로서, 조리 또는 가공 시 식품에 풍미를 부여하기 위하여 사용하는 것을 말한다.

(3) ～ (7) (생   략)

(8) 기타 식용유지가공품

식물성유지 또는 동물성유지를 주원료(다만, 압착한 참기름, 압착한 들기름은 제외한다)로 하여 가공한 것을 말한다.

5) ～ 6) (생   략)

8. ～ 23. (생   략)

제3. ∼ 제4. (생   략)

제4. 식품별 기준 및 규격

1. ～ 6. (현행과 같음)

7. 식용유지류

(현행과 같음)

7-1 식물성유지류

1) 정의

--------------------------- ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------미강유, 참기름, 들기름, 홍화유, ------------

------------------------------------------------------------------------------.

2) (현행과 같음)

3) 제조․가공기준

(1) ～ (3) (현행과 같음)

(4) 참기름과 들기름에는 다른 식용유지를 일절 혼합하여서는 아니 된다.

(5) (현행과 같음)

(6) 향미유 제조시 참깨, 들깨 또는 이들로부터 유래한 유지를 사용하여서는 아니 된다(다만, 식품첨가물 제외).

4) 식품유형

(1) ～ (4) (현행과 같음)

(5) 참기름

참깨로부터 채취한 원유를 식용에 적합하도록 처리한 것을 말한다.

<삭    제>

(6) 들기름

들깨로부터 채취한 원유를 식용에 적합하도록 처리한 것을 말한다.

<삭    제>

(7) ～ (14) (현행과 같음)

(15) 기타식물성유지

단일 식물성 원료로부터 채취한 원료유지를 식용에 적합하도록 처리한 것으로 상기의 (1)～(14)의 식품유형에 해당되지 않는 것을 말한다.

5) 규격

(현행과 같음)

유형

항목

참기름

들기름

(1)산가

0.6 이하

(압착유는 4.0 이하)

0.6 이하

(압착유는 5.0 이하)

(2)요오드가

103~118

160~209

(3)산화방지제

(g/kg)

-

다음에서 정하는 것 이외의 산화방지제가 검출되어서는 아니 된다.

부틸히드록시아니솔 디부틸히드록시톨루엔 터셔리부틸히드로퀴논	0.2 이하(병용할 때에는 부틸히드록시아니솔, 디부틸히드록시톨루엔 및 터셔리부틸히드로퀴논으로서의 사용량의 합계가 0.2 이하)
몰식자산프로필	0.1 이하

(4)리놀렌산

(%)*

0.5 이하

-

(5)에루스산

(%)

검출되어서는 아니 된다.

-

* -------------------------

----------------------------------------------------------------------

(현행과 같음)

6) (현행과 같음)

7-2 (현행과 같음)

7-3 식용유지가공품

1) ∼ 2) (현행과 같음)

3) 제조․가공기준

(1) 참기름과 들기름에는 다른 식용유지를 일절 혼합하여서는 아니 된다.

4) 식품유형

(1) 혼합식용유

이 고시에서 제품유형이 정하여진 2종 이상의 식용유지(다만, 참기름, 들기름, 향미유는 제외)를 단순히 혼합한 것을 말한다.

(2) 향미유

식용유지(다만, 참기름, 들기름은 제외)에 향신료, 향료, 천연추출물, 조미료 등을 혼합한 것(식용유지 50% 이상)으로서, 조리 또는 가공 시 식품에 풍미를 부여하기 위하여 사용하는 것을 말한다.

(3) ～ (7) (현행과 같음)

(8) 기타 식용유지가공품

식물성유지 또는 동물성유지를 주원료(다만, 참기름, 들기름은 제외)로 하여 가공한 것을 말한다.

5) ～ 6) (현행과 같음)

8. ～ 23. (현행과 같음)

제3. ∼ 제4. (현행과 같음)

제5. 식품접객업소(집단급식소 포함)의 조리식품 등에 대한 기준 및 규격

1. (생   략)

2. 원료 기준

1) 원료의 구비요건

(1) (생   략)

(2) 원료 및 기구 등의 세척, 식품의 조리, 먹는물 등으로 사용되는 물은「먹는물 관리법」의 수질기준에 적합한 것이어야 하며, 노로바이러스가 검출되어서는 아니 된다(수돗물은 제외).

(3) ∼ (4) (생   략)

2) (생   략)

3. ∼ 5. (생   략)

제5. 식품접객업소(집단급식소 포함)의 조리식품 등에 대한 기준 및 규격

1. (현행과 같음)

2. 원료 기준

1) 원료의 구비요건

(1) (현행과 같음)

(2) ---------------------

---------------------

---------------------

---------------------

--------------노로바이러스, A형·E형 간염바이러스, 로타바이러스, 아스트로바이러스, 장관아데노바이러스, 사포바이러스가 검출되어서는 아니된다(단, 수돗물 및 염소 등으로 소독한 식품용수는 제외한다).

(3) ∼ (4) (현행과 같음)

2) (현행과 같음)

3. ∼ 5. (현행과 같음)

제6. (생   략)

제7. 일반시험법

1. ∼ 3. (생  략)

4. 미생물시험법

4.1 ∼ 4.25 (생  략)

<신    설>

<신    설>

<신    설>

<신    설>

<신    설>

<신    설>

5. ～ 9. (생   략)

10. 식품 중 유해물질

10.1 ～ 10.3 (생   략)

10.4 발기부전치료제 및 그 유사물질

가. ～ 다. (생   략)

라. 시약 및 시액

1) ～ 2) (생   략)

3) 표준원액 : 호모실데나필(homosildenafil), 홍데나필(hongdenafil), 하이드록시호모실데나필(hydroxyhomosildenafil), 아미노타다라필(aminotadalafil), 슈도바데나필(pseudovardenafil), 하이드록시홍데나필(hydroxyhongdenafil), 디메틸실데나필(dimethylsildenafil), 잔소안트라필(xanthoanthrafil), 하이드록시바데나필(hydroxyvardenafil), 노르네오실데나필(norneosildenafil), 데메틸홍데나필(demethylhongdenafil), 피페리디노홍데나필(piperidinohongdenafil), 카보데나필(carbodenafil), 치오실데나필(thiosildenafil), 디메틸치오실데나필(dimethylthiosildenafil), 아세틸바데나필(acetylvardenafil), 벤질실데나필(benzylsildenafil), 노르네오바데나필(norneovardenafil), 옥소홍데나필(oxohongdenafil), 치오호모실데나필(thiohomosildenafil), 데설포바데나필(desulfovardenafil), 니트로데나필(nitrodenafil), 싸이클로펜티나필(cyclopenpentynafil), 옥틸노르타다라필(octylnortadalafil), 클로로데나필(chlorodenafil), 신나밀데나필(cinnamyldenafil), 치오퀴나피페리필(thioquinapiperifil), 하이드록시치오호모실데나필(hydroxythiohomosildenafil), 클로로프레타다라필(chloropretadalafil), 하이드록시클로로데나필(hydroxychlorodenafil), 디클로로데나필(dichlorodenafil), 데메칠타다라필(demethyltadalafil), 아세트아미노타다라필(acetaminotadalafil), 메틸하이드록시호모실데나필(methylhydroxyhomosildenafil), 프로폭시페닐치오호모실데나필(propoxyphenylthiosildenafil), 프로폭시페닐치오하이드록시호모실데나필(propoxyphenylthiohydroxyhomosildenafil), 프로폭시페닐치오실데나필(propoxyphenylthiosildenafil), 프폭시페닐치오아일데나필(Propoxyphenylthioaildenafil), 호모타다라필(Homotadalafil), 아세틸산(acetyl acid), 겐데나필(gendenafil), 이미다조사가트리아지논(imidazosagatriazinone), cis-사이클로펜틸타다라필(cis-cyclopentyltadalafil), trans-사이클로펜틸타다라필(trans-cyclopentyltadalafil), 실데나필(sildenafil), 타다라필(tadalafil), 바데나필(vardenafil), 유데나필(udenafil), 미로데나필(mirodenafil), 아바나필(avanafil) 각각의 표준품을 메탄올에 녹여 각각 1,000 mg/L이 되게 한다.

4) ∼ 6) (생   략)

마. ∼ 아. (생   략)

자. 확인시험

(생   략)

1) 액체크로마토그래프/질량분석기의 측정조건

가) 칼럼 : C18 (2.0 mm × 150 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) (생   략)

다) 이동상

(1) 이동상 A : 0.1% formic acid

(2) (생   략)

라) ∼ 사) (생   략)

차. 발기부전치료제 유사물질의 분자량 및 화학구조식

① 호모실데나필(Homosildenafil) (C23H32N6O4S, 488)	② 홍데나필(Hongdenafil) (C25H34N6O3, 466)
③ 하이드록시호모실데나필 (Hydroxy homosildenafil) (C23H32N6O5S, 504)	④ 아미노타다라필(Amino tadalafil) (C21H18N4O4, 390)
⑤ 슈도바데나필(Pseudo-vardenafil) (C22H29N5O4S, 459)	⑥ 하이드록시홍데나필(Hydroxy hongdenafil) (C25H34N6O4, 482)
⑦ 디메칠실데나필(Dimethylsildenafil) (C23H32N6O4S, 488)	⑧ 잔소안트라필(Xanthoanthrafil) (C19H23N3O6, 389)
⑨ 하이드록시바데나필(Hydroxyvardenafil) (C23H32N6O5S, 504)	⑩ 노르네오실데나필(Norneosildenafil) (C22H29N5O4S, 459)
⑪ 데메틸홍데나필(demethylhongdenafil) (C24H32N6O3, 452)	⑫ 피페리디노홍데나필(piperidinohongdenafil) (C24H31N5O3, 437)
⑬ 카보데나필(carbodenafil) (C24H32N6O3, 452)	⑭ 치오실데나필(thiosildenfil) (C20H30N6O3S2, 490)
⑮ 디메틸치오실데나필 (dimethylthiosildenafil) (C23H32N6O3S2, 504)	⑯ 아세틸바데나필(acetylvardenafil) (C25H34N6O3, 466)
⑰ 벤질실데나필(benzylsildenafil) (C28H34N6O4S, 550)	⑱ 노르네오바데나필(norneovardenafil) (C18H20N4O4, 356)
⑲ 옥소홍데나필(oxohongdenafil) (C25H32N6O4, 480)	치오호모실데나필(thiohomosildenafil) (C23H32N6O3S2, 504)
데설포바데나필(desulfovardenafil) (C17H20N4O2, 312)	니트로데나필(nitrodenafil)
싸이클로펜티나필(cyclopentynafil)	옥틸노르타다라필(octylnortadalafil)
클로로데나필(chlorodenafil) (C19H21ClN4O3, 388)	신나밀데나필(cinnamyldenafil) (C32H38N6O3, 554)
치오퀴나피페리필(Thioquinapiperifil) (C24H28N6OS, 448)	하이드록시치오호모실데나필 (hydroxythiohomosildenafil) (C23H32N6O4S2, 520)
클로로프레타다라필(Chloropretadalafil) (C22H19ClN2O5, 426)	하이드록시클로로데나필(Hydroxychlorodenafil) (C19H23ClN4O3, 390)
디클로로데나필(Dichlorodenafil) (C19H21Cl2N4O2, 406)	데메칠타다라필(Demethyltadalafil) (C21H17N3O4, 375)
아세트아미노타다라필(Acetaminotadalafil) (C23H20N4O5, 432.43)	㉞메틸하이드록시호모실데나필(Methylhydroxyhomosildenafil) (C24H34N6O5S, 518)
㉟ 프로폭시페닐 치오호모실데나필 (Propoxyphenyl thiohomosildenafil) (C24H34N6O3S2, 518.70)	㊱ 프로폭시페닐 치오하이드록시호모실데나필 (Propoxyphenyl thiohydroxyhomosildenafil) (C24H34N6O4S2, 534.69)
㊲ 프로폭시페닐치오실데나필 (Propoxyphenylthiosildenafil) (C23H32N6O3S2, 504.67)	프로폭시페닐치오아일데나필 (Propoxyphenylthioaildenafil) (C24H34N6O3S2, 518.70)
호모타다라필(Homotadalafil) (C23H21N3O4, 403.43)	㊵ 아세틸산(Acetyl acid) (C18H20N4O4, 356)
㊶ 겐데나필(Gendenafil) (C19H22N4O3, 354)	㊷ 이미다조사가트리아지논(Imidazosagatriazinone) (C17H20N4O2, 312)
㊸ cis-사이클로펜틸타다라필(cis-Cyclopentyltadalafil) (C26H25N3O4, 443)	㊹ trans-사이클로펜틸타다라필(trans-Cyclopentyltadalafil) (C26H25N3O4, 443)
<신 설>

10.5 ～ 10.6 (생  략)

제6. (현행과 같음)

제7. 일반시험법

1. ∼ 3. (현행과 같음)

4. 미생물시험법

4.1 ∼ 4.25 (현행과 같음)

4.26 식품용수 등의 A형 간염바이러스

가. 시약 및 시액

1) 2% 티오황산나트륨(Sodium thiosulfate: Na2S2O3) 용액

4,800 mL의 증류수에 티오황산나트륨 100 g을 녹여 최종 5,000 mL의 용액을 제조하고 121℃, 15분간 고압증기 멸균한다.

2) 1M 염산(HCl) 용액

1M 염산(HCl) 용액은 식품용수 채수 시 검체의 pH를 조정하는데 사용한다.

3) 1.5% Beef extract(desiccated powder) 용액

1,900 mL의 증류수에 Beef extract 분말 30 g과 glycine 7.5 g(최종농도 = 0.05 M)을 넣고 1M  NaOH를 이용하여 pH 9.5로 조정한 후 최종 2 L로 제조하고 121℃, 15분간 고압증기 멸균한다. Beef extract 용액은 4℃에서 일주일간 혹은 -20℃에서 장기간동안 보관할 수 있다.

4) 0.15 M 인산일수소나트륨, 7수화물(Sodium phosphate, dibasic, (Na2HPO4  7H2O)) 용액

950 mL의 증류수에 Sodium phosphate 40.2 g을 넣고 1M  NaOH를 이용하여 pH 9.5로 조정한 후 최종 1 L로 제조하고 121℃, 15분간 고압증기 멸균한다.

5) 1M 수산화나트륨(NaOH) 용액

400 mL의 증류수에 20 g의 수산화나트륨을 넣고 최종 500 mL로 제조하여 수산화나트륨 용액을 준비한다. 수산화나트륨 용액은 상온에서 수개월 동안 보관할 수 있다.

6) 바이러스 유전자 추출 키트(Viral RNA Mini Kits)

시판되는 바이러스 RNA 추출 키트(kit)를 사용한다.

※ 재현성 및 검출효율 등을 고려하여 QIAGEN-Viral RNA Mini Kits 또는 동등 이상의 제품사용 가능

나. 장치 및 기구

1) 검체 채수과정

가) 표준필터장치：식품용수 1,500 ∼1,800 L을 채수하는 장치

구성 : 용수 유입구, 단일주입기, 유량조절밸브, 압력게이지, 탈리액 주입구, 양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter), 카트리지 하우징(cartridge housing), 탈리액 유출구, 유량계, 용수 유출구

※ 양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter) : 1-MDS, NanoCeram 또는 이와 동등한 것

나) 휴대용 pH 측정기：식품용수의 수소이온농도를 측정한다.

다) 휴대용 탁도 측정기：식품용수의 혼탁도를 측정한다.

라) 휴대용 염소 농도 측정기：식품용수의 잔류염소농도를 측정한다.

마) 휴대용 아이스박스：식품용수 채수 후 양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter)를 운반하기 위해 사용한다.

바) 상업용 얼음팩：양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter) 운반 시 냉장상태 유지용으로 사용한다.

사) 기타：공구상자, 2 L 멸균 비커, 멸균된 알루미늄박, 클램프, 바이러스시료 검체기록부, 멸균장갑, 수은온도계, 멸균 메스실린더, 채수용 호스

ⓐ 용수 유입구 ⓑ 단일주입기 ⓒ 유량조절밸브 ⓓ 압력게이지 ⓔ 탈리액 주입구 ⓕ 감압단추 ⓖ 양전하 카트리지 필터 ⓗ 카트리지 하우징 ⓘ 탈리액 유출구 ⓙ 유량계 ⓚ 용수 유출구

《표준필터장치》

2) 바이러스 탈리과정

가) 연동정량펌프：1.5% 양전하 카트리지 필터로 유입시켜 흡착된 바이러스를 탈리하기 위한 장치

나) 연동정량펌프 탈리액 유입용 호스, 탈리액 유출용 호스

다) 자석교반기 및 자석교반 막대

라) 하우징 거치대, 탈리액 유입구, 탈리액 유출구, 압력게이지

3) 바이러스 농축과정

가) 원심분리기(4 ℃, 2,500∼10,000 G)

나) 원심분리용기(50∼500 mL 용량)

다) 0.22 μm 주사기 필터(30 mL 용량)

다. 시험방법

1) 식품용수 채수

채수할 때는 멸균된 장갑을 착용하여 바이러스가 오염되지 않게 주의하고 오염이 될 수 있는 환경요인들을 피하여야 한다. 멸균된 장갑이 사람의 피부나 오염 가능성이 있는 장치, 부품에 접촉이 되었을 경우 장갑을 바꿔 착용한다(예 : 수도꼭지나 다른 환경요소 표면).

가) 채수하려는 검체의 배출구(수도꼭지 등)를 2～3분 정도 열고 식품용수를 흘려보낸다. 배출구에 채수호스를 장착 시 누수가 되지 않도록 클램프를 이용하여 단단히 연결하고 탁도가 균일할 때까지 흘려보낸 후 배출구를 잠근다.

나) 염소계소독제(예, HOCl 등)나 불꽃버너를 이용하여 배출구(수도꼭지 등)를 살균 또는 가열한다.

다) 채수용 호스의 알루미늄박을 제거한 후 채수 할 배출구에 연결하고 표준필터장치 용수 유입구(ⓐ)에 호스를 연결한다. 이 단계에서 양전하 카트리지 필터(ⓖ)는 연결하지 않는다.

라) 천천히 배출구를 열어 압력게이지가 200 kPa(30 PSI)가 넘지 않도록 배출구를 조절하고 76 L(20 gal)의 식품용수를 흘려보낸다.

마) 식품용수 76 L를 흘려 보낸 후 일부를 2 L 멸균 비커에 받아 용수의 탁도, pH, 온도, 염소농도를 각 각 측정하여 검체번호, 채수위치, 채수자의 이름과 함께 바이러스 검체채수기록부에 기록한다. pH 측정기는 사용 전 보정(calibration) 한다.

바) 용수 배출구(수도꼭지 등)를 잠그고 검체가 다음의 조건에 해당되어 부가장치의 연결이 필요한지의 여부를 결정하여 연결한다.

(1) pH 8이상일 경우 멸균된 튜브로 단일주입기(ⓑ)와 1 M 염산 용액이 담긴 메스실린더를 연결하고, 배출구(수도꼭지 등)를 다시 열어 용수의 pH가 6.5～7.5가 되도록 단일 주입기를 통해 1 M 염산 용액을 흘려보낸다. 용수유출구(ⓚ)로 흘러나온 용수의 pH를 측정해 바이러스 검체 채수기록부에 기록한다.

(2) 잔류염소 제거를 위해 위와 같이 단일주입기를 연결하여 식품용수 3.8 L(1 gal) 당 2% 티오황산나트륨 용액 10 mL이 주입되도록 한다.

* (1)와 (2)번이 모두 해당할 경우 이중주입기를 연결하여 사용한다.

사) 바이러스검체 채수기록부에 검체 채취일, 시작 시간, 유량계의 초기 수치를 기록한다.

아) 알루미늄박을 제거한 양전하 카트리지 필터를 탈리액 주입구(ⓔ)와 유출구(ⓘ) 사이에 연결한다.

자) 용수를 천천히 흐르게 하면서 카트리지 하우징 상단의 감압단추(ⓕ, vent button)를 눌러 내부공기가 완전히 빠지도록 한 후, 수도꼭지를 완전히 열어 준다.

차) 압력게이지가 200 kPa(30 PSI) 이하로 유지되도록 유량조절 밸브를 조정하고 식품용수 1,500～1,800 L를 통과시킨 후, 용수 배출구(수도꼭지 등)를 잠근다.

카) 바이러스 검체 채수기록부에 검체채취 종료일, 종료 시간, 유량계의 최종 수치 등을 기록한다.

타) 표준필터장치로부터 카트리지 하우징(ⓗ)을 분리하고 양전하 카트리지 필터를 거꾸로 하여 남은 물을 버린 후 하우징 양끝의 연결된 개구부를 멸균된 알루미늄박으로 싼다.

파) 양전하 카트리지 필터를 아이스박스에 담고 얼음팩 등을 사용하여 냉장상태(냉동시켜서는 아니 된다)로 유지하여 즉시 실험실로 운반한다.

2) 바이러스 탈리과정

가) 냉장 보관하여 운반한 필터는 채수 시작 시간부터 24시간 내에 실험실에서 바이러스 탈리 시험을 실시하여야 한다. 다만, 부득이한 경우로 인해 24시간 내에 탈리시험이 불가할 경우 최대 72시간이 넘지 않도록 한다.

나) 탈리용 거치대에 카트리지 하우징을 장착한 후 유량조절 밸브를 모두 닫는다.

다) 탈리액 주입구에 연동정량펌프 호스를 연결한 후 연동정량펌프와 1.5% Beef extract 용액이 채워져 있는 유리병에 호스를 차례로 연결하되, 1-MDS 필터는 1 L, NanoCeram 필터에는 0.5 L의 1.5% Beef extract 용액을 사용한다.

라) 탈리액 유출구에 유출용 호스를 연결하여 1.5% Beef extract 용액이 들어 있는 유리병에 넣고 탈리액 유출구를 닫는다.

마) 연동정량펌프를 가동하여 양전하 카트리지 필터 하우징 안으로 1.5% Beef extract 용액이 양전하 카트리지 필터 내에 완전히 차도록 한 후 감압단추를 통해 1.5% Beef extract 용액이 넘쳐 흘러나오기 시작하면 감압단추에서 손을 떼고, 연동정량펌프 가동을 멈춘 후 5분간 정치한다.

※ 감압단추는 탈리액이 양전하 카트리지 필터 안으로 가득 채워질 때까지 눌러준다.

바) 탈리액 유출구를 열고 연동정량펌프를 다시 가동한 후 하우징에 채워져 있는 1.5% Beef extract 용액이 서서히 필터를 통과하도록 한다. 통과한 완충액은 1.5% Beef extract 용액이 들어있던 유리병에 수집한다. 탈리액을 회수할 때는 거품이 없도록 주의하여야 한다.

※ 연동정량펌프 대신 양압펌프와 압력통을 사용하여 탈리과정을 진행할 수도 있다.

사) 유리병에 수집된 탈리액은 라)～바)의 과정을 2회 반복한다.

아) 최종 탈리액은 1 M 염산 용액으로 pH를 7.0～7.5 사이로 조절하고 멸균된 메스실린더를 사용하여 부피를 기록한다.

자) 탈리액은 24시간 이내에 농축시험이 가능할 경우 4℃에서 보관하며, 농축 시험을 즉시 시행하기 어려울 때에는 -70℃에서 보관한다.

3) 바이러스 농축과정

가) 최종 탈리액을 교반기에서 혼합하면서 1 M 염산용액으로 pH를 3.5±0.1로 조절한 후, 실온에서 30분간 천천히 섞는다.

나) 침전물이 생기면 탈리액을 멸균한 원심분리용기에 옮겨 원심분리한다(2,500 G 15분, 4℃).

다) 원심분리 후, 상등액을 제거하고 남은 침전물에 0.15 M sodium phosphate 완충액(pH 9.0～9.5)을 20～30 mL 넣어 완전히 부유 시킨 후 실온에 10분간 방치한다.

라) 부유시킨 용액을 원심분리한다(7,000 G, 10분, 4℃).

마) 상등액을 취해 1 M 염산용액으로 pH 7.0～7.5로 조절한다.

바) 미생물오염을 방지하기 위해 30 mL 주사기를 이용하여 상등액을 0.22 μm 주사기 필터로 여과한다. 검체 중의 바이러스가 필터에 흡착되는 것을 방지하기 위하여 사전에 0.22 μm 주사기 필터에 10～20 mL의 1.5% Beef extract 용액(pH 7.0～7.5)을 통과시킨다.

사) 최종 농축 검체량(FCSV=final concentrated sample volume)을 기록하고 검체를 24시간 이내에 분석할 경우는 4℃에 보관하고 나머지는 분석 전까지 -70℃에 보관한다.

아) 최종 농축검체 20～30 mL는 바이러스 유전자 추출을 위한 검체로 사용한다.

4) 바이러스 유전자 추출 과정

시판되는 바이러스 RNA 추출 키트(kit)를 사용하며, 제조사가 제시하는 적절한 실험법에 따라 실시한다.

※ 재현성 및 검출효율 등을 고려하여 QIAGEN-Viral RNA Mini Kits 또는 동등 이상의 제품이 사용이 가능하며, 또한 자동유전자 추출장치를 사용할 경우에도 바이러스 RNA 추출 키트를 사용하여 바이러스 유전자를 추출할 수 있다.

가) 바이러스 유전자 추출 시 검체와 동일한 과정으로 음성대조군(negative control)을 사용하여 유전자를 추출하며 검체의 경우 시험 진행 중 오염 여부를 확인하기 위해 2개의 RNA를 추출한다.

나) 검체 농축액과 음성대조군 각 280 μL에 AVL 완충액(guanidine thiocyanate 함유) 1,120 μL를 각각 혼합하여 실온에서 10분 동안 방치한 후 가볍게 원심분리기를 이용하여 원심분리(spin-down)한다.

다) 여기에 95～100% 에탄올 1,120 μL을 넣어 혼합한 후 가볍게 원심분리(spin-down)한다.

라) 혼합액 630 μL을 소량 원심(Mini spin) 컬럼으로 옮겨 6,000 G에서 1분간 원심분리하고 컬럼을 새로운 회수용(collection) 튜브로 옮긴 다음 남은 혼합액을 630 μL씩 동일한 방법으로 컬럼에 첨가하여 원심분리한다.

마) 소량 원심(Mini spin) 컬럼을 새로운 회수용(collection) 튜브로 옮겨 AW1 완충액(guanidine hydrochloride 함유) 500 μL을 넣고 6,000 G로 1분간 원심분리 후 컬럼을 새로운 회수용(collection) 튜브로 옮긴다.

바) AW2 완충액 500 μL을 넣고 20,000 G로 3분간 원심분리한 후 컬럼을 새로운 1.5 mL 회수용(collection) 튜브로 옮긴다.

사) AVE 완충액(sodium azide 함유) 60 μL를 넣고 6,000 G로 1분간 원심분리하여 다음의 RT-PCR(Reverse transcription -Polymerase chain reaction)을 수행하기 위한 주형(template)으로 사용한다.

5) A형 간염바이러스 유전자 PCR 과정 및 결과판정

RT-PCR(Reverse transcription -PCR) 과정에서는 A형 간염바이러스를 인위적으로 조합하여 합성한 RNA 등을 PCR 양성대조군으로 사용할 수 있다.

가) One-step RT-PCR(Reverse transcription -PCR) 방법은 아래와 같이 수행한다.

(1) PCR 조성조건은 표 1과 같이 Mastermix(2X) 25 μL, Reverse transcriptase (50unit/μL) 1 μL, 프라이머(HAV1, HAV2)는  각 2 μL, 추출 RNA 5 μL를 첨가하여 증류수로 총 50 μL로 맞추고 반응시킨다.

(2) PCR 반응조건은 표 2와 같이 48℃에서 40분, 95℃에서 4분 DNA를 변성시키고, 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초를 1회로 하여 30회 반응시킨 후, 72℃에서 7분간 연장 반응시킨다. 상기 반응 종료 후 PCR 생성물에 대하여 Nested PCR을 실시한다.

표 1. A형 간염바이러스 One-step RT-PCR(Reverse transcription-PCR) 반응액 조성

Component	Volume	Primers
Mastermix(2X)	25 μL	-
Reverse transcriptase(50unit/μL)	1 μL	-
D.W.	15 μL	-
Forward primer(20pmol)	2 μL	HAV1
Reverse primer(20pmol)	2 μL	HAV2
Extracted RNA, PCR control	5 μL	-
Total	50 μL	-

표 2. A형 간염바이러스 One-step RT-PCR(Reverse transcription-PCR) 반응조건 및 온도

	온도	시간	Cycle
cDNA 합성(cDNA synthesis) 초기 변성(predenaturation)	48℃ 95℃	40 min 4 min	1 cycle
변성(denaturation) 결합(annealing) 확장(extension)	95℃ 55℃ 72℃	30 sec 30 sec 30 sec	30 cycles
최종신장(post-elongation)	72℃	7 min	1 cycle
보관	4℃	∞	∞

나) Nested PCR 방법은 아래와 같이 수행한다.

(1) One-step RT-PCR(Reverse transcription-PCR) 산물을 주형으로 하여 표 3과 같이 Nested PCR을 실시한다. 1차 PCR산물 5 μL, 10x 완충액(MgCl2 포함) 5 μL, dNTPs(10 mM) 4 μL, Taq DNA polymerase(5 unit/μL) 1 μL, 프라이머(HAV3, HAV4)는 각 2 μL 첨가한 다음 최종 증류수로 총 50 μL로 맞춘 후 Nested PCR을 실시한다.

(2) PCR 반응조건은 표 4와 같이 95℃에서 4분간 DNA를 변성시키고 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초를 1회로 하여 30회를 반응시킨 후 72℃에서 7분간 연장 반응시킨다.

표 3. A형 간염바이러스 Nested PCR 반응액 조성

Component	Volume	primers
dNTPs(10mM)	4 μL	-
10x Buffer(with MgCl2)	5 μL	-
D.W.	31 μL	-
Forward primer(20 pmol)	2 μL	HAV3
Reverse primer(20 pmol)	2 μL	HAV4
Taq DNA polymerase(5 unit/μL)	1 μL	-
1st PCR Product	5 μL	-
Total	50 μL

표 4. A형 간염바이러스  Nested PCR 반응조건 및 온도

	온도	시간	cycle
초기 변성 (predenaturation)	95℃	4 min	1 cycle
변성(denaturation) 결합(annealing) 확장(extension)	95℃ 55℃ 72℃	30 sec 30 sec 30 sec	30 cycles
최종신장(post-elongation)	72℃	7 min	1 cycle
보관	4℃	∞	∞

(3) PCR 반응 종료 후 PCR 증폭 반응액 5 μL를 전기영동 완충액(gel loading buffer) 1 μL와 혼합한 다음 젤(gel)의 각 홈에 검체를 조심스럽게 넣고 나머지 한 홈에 PCR 증폭산물의 크기를 식별하기에 적당한 표식 DNA(marker DNA) 7 μL를 넣는다. 1.5% 아가로스 젤(agarose gel) 상에서 100V로 전기영동한 후 Ethidium Bromide(EtBr) 염색액(10 mg/mL)으로 30분간 염색한 후 증류수로 10분간 탈색하고 자외선 조사기(UV transilluminator)로 조사하여 증폭된 DNA 밴드를 관찰한다.

(4) A형 간염바이러스 유전자 증폭에 사용하는 프라이머는 표 5와 같다.

표 5. A형 간염바이러스 PCR 프라이머 염기서열

Primer	Sequence(5'→3')	Application	PCR Size(bp)
HAV1	GCT CCT CTT TAT CAT GCT ATG GAT	One-step RT-PCR	244
HAV2	CAG GAA ATG TCT CAG GTA CTT TCT	One-step RT-PCR
HAV3	ATG TTA CTA CAC AAG TTG GAG AT	Nested PCR/ Sequencing	186
HAV4	GAT CCT CAA TTG TTG TGA TAG CT	Nested PCR/ Sequencing

다) 1차 결과 확인

(1) 아가로즈 젤(agarose gel)상에서 시료에 PCR 증폭산물이 186 bp(또는 244 bp)의 밴드가 있을 경우 A형 간염 바이러스로 일차 확인한다.

(2) 만일 음성대조군(negative control)에서 PCR 밴드가 확인 될 경우 등은 재시험을 실시해야한다(표 6 참고).

(3) A형 간염바이러스가 일차 확인된 경우 최종 확인을 위하여 아가로스 젤(agarose gel)상에서 해당부위를 절취하여 PCR 산물을 정제한 후 염기서열(DNA sequencing)을 분석하여 최종 판정한다.

표 6. A형 간염바이러스 PCR 결과판정(예시)

	추출 RNA(시료)	음성대조군	1차 판정
1	+	-	PCR 검출
	+
2	+	-	PCR 검출
	-
3	+	+	재 실험
	+
4	-	-	PCR 불검출
	-

+ : A형 간염바이러스 PCR 밴드 확인됨, - : 밴드가 확인되지 않음

라) 최종 검출 판정

(1) 염기서열 분석(DNA sequencing)을 위하여 다)의 (3)에서 정제된 DNA 1 μL를 주형으로  HAV3과 HAV4프라이머를 사용한다.

(2) 염기서열 분석(sequencing) 반응을 위한 혼합 조건은 각 유전자형 Nested 프라이머(primer, 1 pmol)를 독립된 각각의 튜브에 2 μL, dye-terminator 2 μL, 정제 DNA 2 μL를 첨가하여 증류수로 최종 10 μL가 되도록 하고 96℃에서 1분간 DNA를 변성시킨 후, 96℃에서 10초간, 50℃에서 5초간, 60℃에서 4분간을 1회로 하여 25회 반응시킨 다음 60℃에서 10분간 연장반응을 시킨다.

(3) PCR 산물은 염기서열 분석(DNA sequencing)하되 2종 이상의 유전자가 혼합되어 있는 경우에는 클로닝 염기서열 분석(Cloning DNA sequencing)을 재실시 한다. 염기서열 분석(DNA sequencing)에 의해 결정된 염기서열은 A형 간염바이러스 유전자 데이터베이스(Referecne sequence 및 NCBI blast)와 비교하여 A형 간염바이러스로 확인되었을 경우 검출된 것으로 최종 확인한다.

4.27 식품용수 등의 E형 간염바이러스

가. 시약 및 시액

1) 2% 티오황산나트륨(Sodium thiosulfate: Na2S2O3) 용액

4,800 mL의 증류수에 티오황산나트륨 100 g을 녹여 최종 5,000 mL의 용액을 제조하고 121℃, 15분간 고압증기 멸균한다.

2) 1M 염산(HCl) 용액

1M 염산(HCl) 용액은 식품용수 채수 시 검체의 pH를 조정하는데 사용한다.

3) 1.5% Beef extract(desiccated powder) 용액

1,900 mL의 증류수에 Beef extract 분말 30 g과 glycine 7.5 g(최종농도 = 0.05 M)을 넣고 1M NaOH를 이용하여 pH 9.5로 조정한 후 최종 2 L로 제조하고 121℃, 15분간 고압증기 멸균한다. Beef extract 용액은 4℃에서 일주일간 혹은 -20℃에서 장기간동안 보관할 수 있다.

4) 0.15 M 인산일수소나트륨, 7수화물(Sodium phosphate, dibasic, (Na2HPO4  7H2O)) 용액

950 mL의 증류수에 Sodium phosphate 40.2 g을 넣고 1M  NaOH를 이용하여 pH 9.5로 조정한 후 최종 1 L로 제조하고 121℃, 15분간 고압증기 멸균한다.

5) 1M 수산화나트륨(NaOH) 용액

400 mL의 증류수에 20 g의 수산화나트륨을 넣고 최종 500 mL로 제조하여 수산화나트륨 용액을 준비한다. 수산화나트륨 용액은 상온에서 수개월 동안 보관할 수 있다.

6) 바이러스 유전자 추출 키트(Viral RNA Mini Kits)

시판되는 바이러스 RNA 추출 키트(kit)를 사용한다.

※ 재현성 및 검출효율 등을 고려하여 QIAGEN-Viral RNA Mini Kits 또는 동등 이상의 제품사용 가능

나. 장치 및 기구

1) 검체 채수과정

가) 표준필터장치：식품용수 1,500 ∼1,800 L을 채수하는 장치

구성 : 용수 유입구, 단일주입기, 유량조절밸브, 압력게이지, 탈리액 주입구, 양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter), 카트리지 하우징(cartridge housing), 탈리액 유출구, 유량계, 용수 유출구

※ 양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter) : 1-MDS, NanoCeram 또는 이와 동등한 것

나) 휴대용 pH 측정기：식품용수의 수소이온농도를 측정한다.

다) 휴대용 탁도 측정기：식품용수의 혼탁도를 측정한다.

라) 휴대용 염소 농도 측정기：식품용수의 잔류염소농도를 측정한다.

마) 휴대용 아이스박스：식품용수 채수 후 양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter)를 운반하기 위해 사용한다.

바) 상업용 얼음팩：양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter) 운반 시 냉장상태 유지용으로 사용한다.

사) 기타：공구상자, 2 L 멸균 비커, 멸균된 알루미늄박, 클램프, 바이러스시료 검체기록부, 멸균장갑, 수은온도계, 멸균 메스실린더, 채수용 호스

ⓐ 용수 유입구 ⓑ 단일주입기 ⓒ 유량조절밸브 ⓓ 압력게이지 ⓔ 탈리액 주입구 ⓕ 감압단추 ⓖ 양전하 카트리지 필터 ⓗ 카트리지 하우징 ⓘ 탈리액 유출구 ⓙ 유량계 ⓚ 용수 유출구

《표준필터장치》

2) 바이러스 탈리과정

가) 연동정량펌프：1.5% 양전하 카트리지 필터로 유입시켜 흡착된 바이러스를 탈리하기 위한 장치

나) 연동정량펌프 탈리액 유입용 호스, 탈리액 유출용 호스

다) 자석교반기 및 자석교반 막대

라) 하우징 거치대, 탈리액 유입구, 탈리액 유출구, 압력게이지

3) 바이러스 농축과정

가) 원심분리기(4℃, 2,500∼10,000 G)

나) 원심분리용기(50∼500 mL 용량)

다) 0.22 μm 주사기 필터(30 mL 용량)

다. 시험방법

1) 식품용수 채수

채수할 때는 멸균된 장갑을 착용하여 바이러스가 오염되지 않게 주의하고 오염이 될 수 있는 환경요인들을 피하여야 한다. 멸균된 장갑이 사람의 피부나 오염 가능성이 있는 장치, 부품에 접촉이 되었을 경우 장갑을 바꿔 착용한다(예: 수도꼭지나 다른 환경요소 표면).

가) 채수하려는 검체의 배출구(수도꼭지 등)를 2～3분 정도 열고 식품용수를 흘려보낸다. 배출구에 채수호스를 장착 시 누수가 되지 않도록 클램프를 이용하여 단단히 연결하고 탁도가 균일할 때까지 흘려보낸 후 배출구를 잠근다.

나) 염소계소독제(예, HOCl 등)나 불꽃버너를 이용하여 배출구(수도꼭지 등)를 살균 또는 가열한다.

다) 채수용 호스의 알루미늄박을 제거한 후 채수 할 배출구에 연결하고 표준필터장치 용수 유입구(ⓐ)에 호스를 연결한다. 이 단계에서 양전하 카트리지 필터(ⓖ)는 연결하지 않는다.

라) 천천히 배출구를 열어 압력게이지가 200 kPa(30 PSI)가 넘지 않도록 배출구를 조절하고 76 L(20 gal)의 식품용수를 흘려보낸다.

마) 식품용수 76 L를 흘려 보낸 후 일부를 2 L 멸균 비커에 받아 용수의 탁도, pH, 온도, 염소농도를 각 각 측정하여 검체번호, 채수위치, 채수자의 이름과 함께 바이러스 검체채수기록부에 기록한다. pH 측정기는 사용 전 보정(calibration) 한다.

바) 용수 배출구(수도꼭지 등)를 잠그고 검체가 다음의 조건에 해당되어 부가장치의 연결이 필요한지의 여부를 결정하여 연결한다.

(1) pH 8이상일 경우 멸균된 튜브로 단일주입기(ⓑ)와 1 M 염산 용액이 담긴 메스실린더를 연결하고, 배출구(수도꼭지 등)를 다시 열어 용수의 pH가 6.5～7.5가 되도록 단일 주입기를 통해 1 M 염산 용액을 흘려보낸다. 용수유출구(ⓚ)로 흘러나온 용수의 pH를 측정해 바이러스 검체 채수기록부에 기록한다.

(2) 잔류염소 제거를 위해 위와 같이 단일주입기를 연결하여 식품용수 3.8 L(1 gal) 당 2% 티오황산나트륨 용액 10 mL이 주입되도록 한다.

* (1)와 (2)번이 모두 해당할 경우 이중주입기를 연결하여 사용한다.

사) 바이러스검체 채수기록부에 검체 채취일, 시작 시간, 유량계의 초기 수치를 기록한다.

아) 알루미늄박을 제거한 양전하 카트리지 필터를 탈리액 주입구(ⓔ)와 유출구(ⓘ) 사이에 연결한다.

자) 용수를 천천히 흐르게 하면서 카트리지 하우징 상단의 감압단추(ⓕ, vent button)를 눌러 내부공기가 완전히 빠지도록 한 후, 수도꼭지를 완전히 열어 준다.

차) 압력게이지가 200 kPa(30 PSI) 이하로 유지되도록 유량조절 밸브를 조정하고 식품용수 1,500～1,800 L를 통과시킨 후, 용수 배출구(수도꼭지 등)를 잠근다.

카) 바이러스 검체 채수기록부에 검체채취 종료일, 종료 시간, 유량계의 최종 수치 등을 기록한다.

타) 표준필터장치로부터 카트리지 하우징(ⓗ)을 분리하고 양전하 카트리지 필터를 거꾸로 하여 남은 물을 버린 후 하우징 양끝의 연결된 개구부를 멸균된 알루미늄박으로 싼다.

파) 양전하 카트리지 필터를 아이스박스에 담고 얼음팩 등을 사용하여 냉장상태(냉동시켜서는 아니 된다)로 유지하여 즉시 실험실로 운반한다.

2) 바이러스 탈리과정

가) 냉장 보관하여 운반한 필터는 채수 시작 시간부터 24시간 내에 실험실에서 바이러스 탈리 시험을 실시하여야 한다. 다만, 부득이한 경우로 인해 24시간 내에 탈리시험이 불가할 경우 최대 72시간이 넘지 않도록 한다.

나) 탈리용 거치대에 카트리지 하우징을 장착한 후 유량조절 밸브를 모두 닫는다.

다) 탈리액 주입구에 연동정량펌프 호스를 연결한 후 연동정량펌프와 1.5% Beef extract 용액이 채워져 있는 유리병에 호스를 차례로 연결하되, 1-MDS 필터는 1 L, NanoCeram 필터에는 0.5 L의 1.5% Beef extract 용액을 사용한다.

라) 탈리액 유출구에 유출용 호스를 연결하여 1.5% Beef extract 용액이 들어 있는 유리병에 넣고 탈리액 유출구를 닫는다.

마) 연동정량펌프를 가동하여양전하 카트리지 필터 하우징 안으로 1.5% Beef extract 용액이 양전하 카트리지 필터 내에 완전히 차도록 한 후 감압단추를 통해 1.5% Beef extract 용액이 넘쳐 흘러나오기 시작하면 감압단추에서 손을 떼고, 연동정량펌프 가동을 멈춘 후 5분간 정치한다.

※ 감압단추는 탈리액이 양전하 카트리지 필터 안으로 가득 채워질 때까지 눌러준다.

바) 탈리액 유출구를 열고 연동정량펌프를 다시 가동한 후 하우징에 채워져 있는 1.5% Beef extract 용액이 서서히 필터를 통과하도록 한다. 통과한 완충액은 1.5% Beef extract 용액이 들어있던 유리병에 수집한다. 탈리액을 회수할 때는 거품이 없도록 주의하여야 한다.

※ 연동정량펌프 대신 양압펌프와 압력통을 사용하여 탈리과정을 진행할 수도 있다.

사) 유리병에 수집된 탈리액은 라)～바)의 과정을 2회 반복한다.

아) 최종 탈리액은 1 M 염산 용액으로 pH를 7.0～7.5 사이로 조절하고 멸균된 메스실린더를 사용하여 부피를 기록한다.

자) 탈리액은 24시간 이내에 농축시험이 가능할 경우 4℃에서 보관하며, 농축 시험을 즉시 시행하기 어려울 때에는 -70℃에서 보관한다.

3) 바이러스  농축과정

가) 최종 탈리액을 교반기에서 혼합하면서 1 M 염산용액으로 pH를 3.5±0.1로 조절한 후, 실온에서 30분간 천천히 섞는다.

나) 침전물이 생기면 탈리액을 멸균한 원심분리용기에 옮겨 원심분리한다(2,500 G 15분, 4℃).

다) 원심분리 후, 상등액을 제거하고 남은 침전물에 0.15 M sodium phosphate 완충액(pH 9.0～9.5)을  20～30 mL 넣어 완전히 부유 시킨 후 실온에 10분간 방치한다.

라) 부유시킨 용액을 원심분리한다(7,000 G, 10분, 4℃).

마) 상등액을 취해 1 M 염산용액으로 pH 7.0～7.5로 조절한다.

바) 미생물오염을 방지하기 위해 30 mL 주사기를 이용하여 상등액을 0.22 μm 주사기 필터로 여과한다. 검체 중의 바이러스가 필터에 흡착되는 것을 방지하기 위하여 사전에 0.22 μm 주사기 필터에 10～20 mL의 1.5% Beef extract 용액(pH 7.0～7.5)을 통과시킨다.

사) 최종 농축 검체량(FCSV=final concentrated sample volume)을 기록하고 검체를 24시간 이내에 분석할 경우는 4℃에 보관하고 나머지는 분석 전까지 -70℃에 보관한다.

아) 최종 농축검체 20～30 mL는 바이러스 유전자 추출을 위한 검체로 사용한다.

4) 바이러스 유전자 추출 과정

시판되는 바이러스 RNA 추출 키트(kit)를 사용하며, 제조사가 제시하는 적절한 실험법에 따라 실시한다.

※ 재현성 및 검출효율 등을 고려하여 QIAGEN-Viral RNA Mini Kits 또는 동등 이상의 제품이 사용이 가능하며, 또한 자동유전자 추출장치를 사용할 경우에도 바이러스 RNA 추출 키트를 사용하여 바이러스 유전자를 추출할 수 있다.

가) 바이러스 유전자 추출 시 검체와 동일한 과정으로 음성대조군(negative control)을 사용하여 유전자를 추출하며 검체의 경우 시험 진행 중 오염 여부를 확인하기 위해 2개의 RNA를 추출한다.

나) 검체 농축액과 음성대조군 각 280 μL에 AVL 완충액(guanidine thiocyanate 함유) 1,120 μL를 각각 혼합하여 실온에서 10분 동안 방치한 후 가볍게 원심분리기를 이용하여 원심분리(spin-down)한다.

다) 여기에 95～100% 에탄올 1,120 μL을 넣어 혼합한 후 가볍게 원심분리(spin-down)한다.

라) 혼합액 630 μL을 소량 원심(Mini spin) 컬럼으로 옮겨 6,000 G에서 1분간 원심분리하고 컬럼을 새로운 회수용(collection) 튜브로 옮긴 다음 남은 혼합액을 630 μL씩 동일한 방법으로 컬럼에 첨가하여 원심분리한다.

마) 소량 원심(Mini spin) 컬럼을 새로운 회수용(collection) 튜브로 옮겨 AW1 완충액(guanidine hydrochloride 함유) 500 μL을 넣고 6,000 G로 1분간 원심분리 후 컬럼을 새로운 회수용(collection) 튜브로 옮긴다.

바) AW2 완충액 500 μL을 넣고 20,000 G로 3분간 원심분리한 후 컬럼을 새로운 1.5 mL 회수용(collection) 튜브로 옮긴다.

사) AVE 완충액(sodium azide 함유) 60 μL를 넣고 6,000 G로 1분간 원심분리하여 다음의 RT-PCR(Reverse transcription-Polymerase chain reaction)을 수행하기 위한 주형(template)으로 사용한다.

5) E형 간염바이러스 유전자 PCR 과정 및 결과판정

RT-PCR(Reverse transcription-PCR)과정에서는 E형 간염바이러스를 인위적으로 조합하여 합성한 RNA 등을 PCR 양성대조군으로 사용할 수 있다.

가) One-step RT-PCR(Reverse transcription-PCR) 방법은 아래와 같이 수행한다.

(1) PCR 조성조건은 표 1과 같이 Mastermix(2X) 25 μL, Reverse transcriptase(50 unit/μL) 1 μL, 프라이머(3156N, 3157N)는  각 1 μL, 추출 RNA 5 μL를 첨가하여 증류수로 총 50 μL로 반응시킨다.

(2) PCR 반응조건은 표 2와 같이 50℃에서 15분, 95℃에서 2분 DNA를 변성시키고, 95℃ 20초, 52℃ 30초, 72℃ 1분을 1회로 하여 35회 반응시킨 후, 72℃에서 5분간 연장 반응시킨다. 상기 반응 종료 후 PCR 생성물에 대하여 Nested PCR을 실시한다.

표 1. E형 간염바이러스 One-step RT-PCR(Reverse transcription-PCR) 반응액 조성

Component	Volume	Primer
Mastermix(2X)	25 μL	-
Reverse transcriptase(50unit/μL)	1 μL	-
D.W.	17 μL	-
Forward primer(20pmol)	1 μL	3156N
Reverse primer(20pmol)	1 μL	3157N
Extracted RNA, PCR control	5 μL	-
Total	50 μL	-

표 2. E형 간염바이러스 One-step RT-PCR(Reverse transcription-PCR) 반응조건 및 온도

	온도	시간	Cycle
cDNA 합성(cDNA synthesis) 초기 변성(predenaturation)	50℃ 95℃	15 min 2 min	1 cycle
변성(denaturation) 결합(annealing) 확장(extension)	95℃ 52℃ 72℃	20 sec 30 sec 1 min	35 cycles
최종신장(post-elongation)	72℃	5 min	1 cycle
보관	4℃	∞	∞

나) Nested PCR 방법은 아래와 같이 수행한다.

(1) One-step RT-PCR(Reverse transcription-PCR) 산물을 주형으로 하여 표 3과 같이 Nested PCR을 실시한다. 1차 PCR산물 2 μL, 10x 완충액(MgCl2 포함) 2 μL, dNTPs(10 mM) 2 μL, Taq DNA polymerase(1 unit/μL) 1 μL, 프라이머(3158N, 3159N)는 각 1 μL 첨가한 다음 최종 증류수로 총 20 μL로 맞춘 후 Nested PCR을 실시한다.

(2) PCR 반응조건은 표 4와 같이 94℃에서 5분간 DNA를 변성시키고 94℃ 30초, 52℃ 30초, 72℃ 30초를 1회로 하여 35회를 반응시킨 후 72℃에서 10분간 연장 반응시킨다.

표 3. E형 간염바이러스 Nested PCR 반응액 조성

Component	Volume	Primer
dNTPs(10mM)	2 μL	-
10x Buffer(with MgCl2)	2 μL	-
D.W.	11 μL	-
Forward primer(10 pmol)	1 μL	3158N
Reverse primer(10 pmol)	1 μL	3159N
Taq DNA polymerase(1 unit/μL)	1 μL	-
1st PCR Product	2 μL	-
Total	20 μL

표 4. E형 간염바이러스 Nested PCR 반응조건 및 온도

	온도	시간	cycle
초기 변성 (predenaturation)	94℃	5 min	1 cycle
변성(denaturation) 결합(annealing) 확장(extension)	94℃ 52℃ 72℃	30 sec 30 sec 30 sec	35 cycles
최종신장(post-elongation)	72℃	10 min	1 cycle
보관	4℃	∞	∞

(3) PCR 반응 종료 후 PCR 증폭 반응액 5 μL를 전기영동 완충액(gel loading buffer) 1 μL와 혼합한 다음 젤(gel)의 각 홈에 검체를 조심스럽게 넣고 나머지 한 홈에 PCR 증폭산물의 크기를 식별하기에 적당한 표식 DNA(marker DNA) 7 μL를 넣는다. 1.5% 아가로스 젤(agarose gel) 상에서 100V로 전기영동한 후 Ethidium Bromide(EtBr) 염색액(10 mg/mL)으로 30분간 염색한 후 증류수로 10분간 탈색하고 자외선 조사기(UV transilluminator)로 조사하여 증폭된 DNA 밴드를 관찰한다.

(4) E형 간염바이러스 유전자 증폭에 사용하는 프라이머는 표 5와 같다.

표 5. E형 간염바이러스 One-step RT-PCR(Reverse transcription-PCR) 프라이머 염기서열

Primer	Sequence(5'→3')	Application	PCR Size(bp)
3156N	AAT TAT GCC CAG TAC CGG GTT G	One-step RT-PCR	731
3157N	CCC TTA TCC TGC TGA GCA TTC TC	One-step RT-PCR
3158N	GTT ATG CTT TGC ATA CAT GGC T	Nested PCR/ Sequencing	348
3159N	AGC CGA CGA AAT CAA TTC TGT C	Nested PCR/ Sequencing

다) 1차 결과 확인

(1) 아가로즈 젤(agarose gel)상에서 시료에 증폭산물이 348 bp 경우 E형 간염 바이러스로 일차 확인한다.

(2) 만일 음성대조군(negative control)에서 PCR 밴드가 확인 될 경우 등은 재시험을 실시해야한다(표 6 참고).

(3) E형 간염바이러스가 일차 확인된 경우 최종 확인을 위하여 아가로스 젤(agarose gel)상에서 해당부위를 절취하여 PCR 산물을 정제한 후 염기서열(DNA sequencing)을 분석하여 최종 판정한다.

표 6. E형 간염바이러스 PCR 결과판정(예시)

	추출 RNA(시료)	음성대조군	1차 판정
1	+	-	PCR 검출
	+
2	+	-	PCR 검출
	-
3	+	+	재 실험
	+
4	-	-	PCR 불검출
	-

+ : E형 간염바이러스 PCR 밴드 확인됨, - : 밴드가 확인되지 않음

라) 최종 검출 판정

(1) 염기서열 분석(DNA sequencing)을 위하여 다)의 (3)에서 정제된 DNA 1 μL를 주형으로 3158N과 3159N 프라이머를 사용한다.

(2) 염기서열 분석(sequencing) 반응을 위한 혼합 조건은 각 유전자형 Nested 프라이머(primer, 1 pmol)를 독립된 각각의 튜브에 2 μL, dye-terminator 2 μL, 정제 DNA 2 μL를 첨가하여 증류수로 최종 10 μL가 되도록 하고 96℃에서 1분간 DNA를 변성시킨 후, 96℃에서 10초간, 50℃에서 5초간, 60℃에서 4분간을 1회로 하여 25회 반응시킨 다음 60℃에서 10분간 연장반응을 시킨다.

(3) PCR 산물은 염기서열 분석(DNA sequencing)하되 2종 이상의 유전자가 혼합되어 있는 경우에는 클로닝 염기서열 분석(Cloning DNA sequencing)을 재실시 한다. 염기서열 분석(DNA sequencing)에 의해 결정된 염기서열은 E형 간염바이러스 유전자 데이터베이스(Referecne sequence 및 NCBI blast)와 비교하여 E형 간염바이러스로 확인되었을 경우 검출된 것으로 최종 확인한다.

4.28 식품용수 등의 로타바이러스

가. 시약 및 시액

1) 2% 티오황산나트륨(Sodium thiosulfate: Na2S2O3) 용액

4,800 mL의 증류수에 티오황산나트륨 100 g을 녹여 최종 5,000 mL의 용액을 제조하고 121℃, 15분간 고압증기 멸균한다.

2) 1M 염산(HCl) 용액

1M 염산(HCl) 용액은 식품용수 채수 시 검체의 pH를 조정하는데 사용한다.

3) 1.5% Beef extract(desiccated powder) 용액

1,900 mL의 증류수에 Beef extract 분말 30 g과 glycine 7.5 g(최종농도 = 0.05 M)을 넣고 1M NaOH를 이용하여 pH 9.5로 조정한 후 최종 2 L로 제조하고 121℃, 15분간 고압증기 멸균한다. Beef extract 용액은 4℃에서 일주일간 혹은 -20℃에서 장기간동안 보관할 수 있다.

4) 0.15 M 인산일수소나트륨, 7수화물(Sodium phosphate, dibasic, (Na2HPO4  7H2O)) 용액

950 mL의 증류수에 Sodium phosphate 40.2 g을 넣고 1M  NaOH를 이용하여 pH 9.5로 조정한 후 최종 1 L로 제조하고 121℃, 15분간 고압증기 멸균한다.

5) 1M 수산화나트륨(NaOH) 용액

400 mL의 증류수에 20 g의 수산화나트륨을 넣고 최종 500 mL로 제조하여 수산화나트륨 용액을 준비한다. 수산화나트륨 용액은 상온에서 수개월 동안 보관할 수 있다.

6) 바이러스 유전자 추출 키트(Viral RNA Mini Kits)

시판되는 바이러스 RNA 추출 키트(kit)를 사용한다.

※ 재현성 및 검출효율 등을 고려하여 QIAGEN-Viral RNA Mini Kits 또는 동등 이상의 제품사용 가능

나. 장치 및 기구

1) 검체 채수과정

가) 표준필터장치 : 식품용수 1,500∼1,800 L을 채수하는 장치

구성 : 용수 유입구, 단일주입기, 유량조절밸브, 압력게이지, 탈리액 주입구, 양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter), 카트리지 하우징(cartridge housing), 탈리액 유출구, 유량계, 용수 유출구

※ 양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter) : 1-MDS, NanoCeram 또는 이와 동등한 것

나) 휴대용 pH 측정기：식품용수의 수소이온농도를 측정한다.

다) 휴대용 탁도 측정기：식품용수의 혼탁도를 측정한다.

라) 휴대용 염소 농도 측정기：식품용수의 잔류염소농도를 측정한다.

마) 휴대용 아이스박스：식품용수 채수 후 양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter)를 운반하기 위해 사용한다.

바) 상업용 얼음팩：양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter) 운반 시 냉장상태 유지용으로 사용한다.

사) 기타：공구상자, 2 L 멸균 비커, 멸균된 알루미늄박, 클램프, 바이러스시료 검체기록부, 멸균장갑, 수은온도계, 멸균 메스실린더, 채수용 호스

ⓐ 용수 유입구 ⓑ 단일주입기 ⓒ 유량조절밸브 ⓓ 압력게이지 ⓔ 탈리액 주입구 ⓕ 감압단추 ⓖ 양전하 카트리지 필터 ⓗ 카트리지 하우징 ⓘ 탈리액 유출구 ⓙ 유량계 ⓚ 용수 유출구

《표준필터장치》

2) 바이러스 탈리과정

가) 연동정량펌프：1.5% 양전하 카트리지 필터로 유입시켜 흡착된 바이러스를 탈리하기 위한 장치

나) 연동정량펌프 탈리액 유입용 호스, 탈리액 유출용 호스

다) 자석교반기 및 자석교반 막대

라) 하우징 거치대, 탈리액 유입구, 탈리액 유출구, 압력게이지

3) 바이러스 농축과정

가) 원심분리기(4 ℃, 2,500∼10,000 G)

나) 원심분리용기(50∼500 mL 용량)

다) 0.22 μm 주사기 필터(30 mL 용량)

다. 시험방법

1) 식품용수 채수

채수할 때는 멸균된 장갑을 착용하여 바이러스가 오염되지 않게 주의하고 오염이 될 수 있는 환경요인들을 피하여야 한다. 멸균된 장갑이 사람의 피부나 오염 가능성이 있는 장치, 부품에 접촉이 되었을 경우 장갑을 바꿔 착용한다(예：수도꼭지나 다른 환경요소 표면).

가) 채수하려는 검체의 배출구(수도꼭지 등)를 2～3분 정도 열고 식품용수를 흘려보낸다. 배출구에 채수호스를 장착 시 누수가 되지 않도록 클램프를 이용하여 단단히 연결하고 탁도가 균일할 때까지 흘려보낸 후 배출구를 잠근다.

나) 염소계소독제(예, HOCl 등)나 불꽃버너를 이용하여 배출구(수도꼭지 등)를 살균 또는 가열한다.

다) 채수용 호스의 알루미늄박을 제거한 후 채수 할 배출구에 연결하고 표준필터장치 용수 유입구(ⓐ)에 호스를 연결한다. 이 단계에서 양전하 카트리지 필터(ⓖ)는 연결하지 않는다.

라) 천천히 배출구를 열어 압력게이지가 200 kPa(30 PSI)가 넘지 않도록 배출구를 조절하고 76 L(20 gal)의 식품용수를 흘려보낸다.

마) 식품용수 76 L를 흘려 보낸 후 일부를 2 L 멸균 비커에 받아 용수의 탁도, pH, 온도, 염소농도를 각 각 측정하여 검체번호, 채수위치, 채수자의 이름과 함께 바이러스 검체채수기록부에 기록한다. pH 측정기는 사용 전 보정(calibration) 한다.

바) 용수 배출구(수도꼭지 등)를 잠그고 검체가 다음의 조건에 해당되어 부가장치의 연결이 필요한지의 여부를 결정하여 연결한다.

(1) pH 8이상일 경우 멸균된 튜브로 단일주입기(ⓑ)와 1 M 염산 용액이 담긴 메스실린더를 연결하고, 배출구(수도꼭지 등)를 다시 열어 용수의 pH가 6.5～7.5가 되도록 단일 주입기를 통해 1 M 염산 용액을 흘려보낸다. 용수유출구(ⓚ)로 흘러나온 용수의 pH를 측정해 바이러스 검체 채수기록부에 기록한다.

(2) 잔류염소 제거를 위해 위와 같이 단일주입기를 연결하여 식품용수 3.8 L(1 gal) 당 2% 티오황산나트륨 용액 10 mL이 주입되도록 한다.

*	(1)와 (2)번이 모두 해당할 경우 이중주입기를 연결하여 사용한다.

사) 바이러스검체 채수기록부에 검체 채취일, 시작 시간, 유량계의 초기 수치를 기록한다.

아) 알루미늄박을 제거한 양전하 카트리지 필터를 탈리액 주입구(ⓔ)와 유출구(ⓘ) 사이에 연결한다.

자) 용수를 천천히 흐르게 하면서 카트리지 하우징 상단의 감압단추(ⓕ, vent button)를 눌러 내부공기가 완전히 빠지도록 한 후, 수도꼭지를 완전히 열어 준다.

차) 압력게이지가 200 kPa(30 PSI) 이하로 유지되도록 유량조절 밸브를 조정하고 식품용수 1,500～1,800 L를 통과시킨 후, 용수 배출구(수도꼭지 등)를 잠근다.

카) 바이러스 검체 채수기록부에 검체채취 종료일, 종료 시간, 유량계의 최종 수치 등을 기록한다.

타) 표준필터장치로부터 카트리지 하우징(ⓗ)을 분리하고 양전하 카트리지 필터를 거꾸로 하여 남은 물을 버린 후 하우징 양끝의 연결된 개구부를 멸균된 알루미늄박으로 싼다.

파) 양전하 카트리지 필터를 아이스박스에 담고 얼음팩 등을 사용하여 냉장상태(냉동시켜서는 아니 된다)로 유지하여 즉시 실험실로 운반한다.

2) 바이러스 탈리과정

가) 냉장 보관하여 운반한 필터는 채수 시작 시간부터 24시간 내에 실험실에서 바이러스 탈리 시험을 실시하여야 한다. 다만, 부득이한 경우로 인해 24시간 내에 탈리시험이 불가할 경우 최대 72시간이 넘지 않도록 한다.

나) 탈리용 거치대에 카트리지 하우징을 장착한 후 유량조절 밸브를 모두 닫는다.

다) 탈리액 주입구에 연동정량펌프 호스를 연결한 후 연동정량펌프와 1.5% Beef extract 용액이 채워져 있는 유리병에 호스를 차례로 연결하되, 1-MDS 필터는 1 L, NanoCeram 필터에는 0.5 L의 1.5% Beef extract 용액을 사용한다.

라) 탈리액 유출구에 유출용 호스를 연결하여 1.5% Beef extract 용액이 들어 있는 유리병에 넣고 탈리액 유출구를 닫는다.

마) 연동정량펌프를 가동하여양전하 카트리지 필터 하우징 안으로 1.5% Beef extract 용액이 양전하 카트리지 필터 내에 완전히 차도록 한 후 감압단추를 통해 1.5% Beef extract 용액이 넘쳐 흘러나오기 시작하면 감압단추에서 손을 떼고, 연동정량펌프 가동을 멈춘 후 5분간 정치한다.

※ 감압단추는 탈리액이 양전하 카트리지 필터 안으로 가득 채워질 때까지 눌러준다.

바) 탈리액 유출구를 열고 연동정량펌프를 다시 가동한 후 하우징에 채워져 있는 1.5% Beef extract 용액이 서서히 필터를 통과하도록 한다. 통과한 완충액은 1.5% Beef extract 용액이 들어있던 유리병에 수집한다. 탈리액을 회수할 때는 거품이 없도록 주의하여야 한다.

※ 연동정량펌프 대신 양압펌프와 압력통을 사용하여 탈리과정을 진행할 수도 있다.

사) 유리병에 수집된 탈리액은 라)～바)의 과정을 2회 반복한다.

아) 최종 탈리액은 1 M 염산 용액으로 pH를 7.0～7.5 사이로 조절하고 멸균된 메스실린더를 사용하여 부피를 기록한다.

자) 탈리액은 24시간 이내에 농축시험이 가능할 경우 4℃에서 보관하며, 농축 시험을 즉시 시행하기 어려울 때에는 -70℃에서 보관한다.

3) 바이러스 농축과정

가) 최종 탈리액을 교반기에서 혼합하면서 1 M 염산용액으로 pH를 3.5±0.1로 조절한 후, 실온에서 30분간 천천히 섞는다.

나) 침전물이 생기면 탈리액을 멸균한 원심분리용기에 옮겨 원심분리한다(2,500 G 15분, 4℃).

다) 원심분리 후, 상등액을 제거하고 남은 침전물에 0.15 M sodium phosphate 완충액(pH 9.0～9.5)을  20～30 mL 넣어 완전히 부유 시킨 후 실온에 10분간 방치한다.

라) 부유시킨 용액을 원심분리한다(7,000 G, 10분, 4℃).

마) 상등액을 취해 1 M 염산용액으로 pH 7.0～7.5로 조절한다.

바) 미생물오염을 방지하기 위해 30 mL 주사기를 이용하여 상등액을 0.22 μm 주사기 필터로 여과한다. 검체 중의 바이러스가 필터에 흡착되는 것을 방지하기 위하여 사전에 0.22 μm 주사기 필터에 10～20 mL의 1.5% Beef extract 용액(pH 7.0～7.5)을 통과시킨다.

사) 최종 농축 검체량(FCSV=final concentrated sample volume)을 기록하고 검체를 24시간 이내에 분석할 경우는 4℃에 보관하고 나머지는 분석 전까지 -70℃에 보관한다.

아) 최종 농축검체 20～30 mL는 바이러스 유전자 추출을 위한 검체로 사용한다.

4) 바이러스 유전자 추출 과정

시판되는 바이러스 RNA 추출 키트(kit)를 사용하며, 제조사가 제시하는 적절한 실험법에 따라 실시한다.

※ 재현성 및 검출효율 등을 고려하여 QIAGEN-Viral RNA Mini Kits 또는 동등 이상의 제품이 사용이 가능하며, 또한 자동유전자 추출장치를 사용할 경우에도 바이러스 RNA 추출 키트를 사용하여 바이러스 유전자를 추출할 수 있다.

가) 바이러스 유전자 추출 시 검체와 동일한 과정으로 음성대조군(negative control)을 사용하여 유전자를 추출하며 검체의 경우 시험 진행 중 오염 여부를 확인하기 위해 2개의 RNA를 추출한다.

나) 검체 농축액과 음성대조군 각 280 μL에 AVL 완충액(guanidine thiocyanate 함유) 1,120 μL를 각각 혼합하여 실온에서 10분 동안 방치한 후 가볍게 원심분리기를 이용하여 원심분리(spin-down)한다.

다) 여기에 95～100% 에탄올 1,120 μL을 넣어 혼합한 후 가볍게 원심분리(spin-down)한다.

라) 혼합액 630 μL을 소량 원심(Mini spin) 컬럼으로 옮겨 6,000 G에서 1분간 원심분리하고 컬럼을 새로운 회수용(collection) 튜브로 옮긴 다음 남은 혼합액을 630 μL씩 동일한 방법으로 컬럼에 첨가하여 원심분리한다.

마) 소량 원심(Mini spin) 컬럼을 새로운 회수용(collection) 튜브로 옮겨 AW1 완충액(guanidine hydrochloride 함유) 500 μL을 넣고 6,000 G로 1분간 원심분리 후 컬럼을 새로운 회수용(collection) 튜브로 옮긴다.

바) AW2 완충액 500 μL을 넣고 20,000 G로 3분간 원심분리한 후 컬럼을 새로운 1.5 mL 회수용(collection) 튜브로 옮긴다.

사) AVE 완충액(sodium azide 함유) 60 μL를 넣고 6,000 G로 1분간 원심분리하여 다음의 RT-PCR(Reverse transcription-Polymerase chain reaction)을 수행하기 위한 주형(template)으로 사용한다.

5)  로타바이러스 유전자 PCR 과정 및 결과판정

로타바이러스 PCR을 위한 RNA는 95℃, 5분 동안 Pre-denaturation 한 후 4℃에서 5분간 방치하고 사용한다. RT-PCR(Reverse transcription-PCR) 과정에서는 로타바이러스를 인위적으로 조합하여 합성한 RNA 등을 PCR 양성대조군으로 사용할 수 있다. 로타바이러스 PCR은 VP4와 VP7 유전자 두 부위를 개별적으로 각각 증폭한다.

가) VP4와  VP7 유전자 One -step RT-PCR(Reverse transcription-PCR) 방법은 아래와 같이 수행한다.

(1) PCR 조성조건은 표1과 같이 One-step RT PCR(Reverse transcription-PCR) Mastermix 13.5 μL, 프라이머(VP4 : VP4F-M(20 pmol), Con2(20 pmol), VP7 : Beg-9(20 pmol), End-9(20 pmol))은 각 1 μL, 추출 RNA 5 μL를 첨가하여 증류수로 총 25 μL로 맞추고 반응시킨다.

(2) VP4 PCR 반응조건은 표 2와 같이 42℃에서 40분 cDNA를 합성하고, 95℃ 15분 동안 초기 변성 후, 94℃ 1분, 50℃ 1분, 72℃ 1분을 1회로 하여 35회 반응시킨 후, 72℃에서 7분간 연장 반응시킨다. VP7 PCR 반응조건은 표 3과 같이 42℃에서 30분 cDNA를 합성하고, 95℃ 15분 동안 초기 변성 후, 94℃ 30초, 42℃ 30초, 72℃ 1분를 1회로 하여 35회 반응시킨 후, 72℃에서 7분간 연장 반응시킨다.

표 1. 로타바이러스 One-step RT-PCR(Reverse transcription-PCR) 반응액 조성 (VP4, VP7 개별)

Component	Volume	Primers
		VP4	VP7
2X One-step RT- PCR Mastermix	13.5 μL	-
D.W.	4.5 μL	-
Forward primer (20pmol)	1 μL	VP4F-M	Beg-9
Reverse primer (20pmol)	1 μL	Con2	End-9
Extracted RNA	5 μL	-
Total	25 μL	-

표 2.  로타바이러스 VP4 부분 One-step RT-PCR(Reverse transcription-PCR) 반응조건 및 온도

	온도	시간	Cycle
cDNA 합성(cDNA synthesis)	42℃	40 min	1 cycle
초기 변성(predenaturation)	95℃	15 min	1 cycle
변성(denaturation) 결합(annealing) 확장(extension)	94℃ 50℃ 72℃	1 min 1 min 1 min	35 cycles
최종신장(post-elongation)	72℃	7 min	1 cycle
보관	4℃	∞	∞

표 3.  로타바이러스 VP7 부분 One-step RT-PCR(Reverse transcription-PCR) 반응조건 및 온도

	온도	시간	Cycle
cDNA 합성(cDNA synthesis)	42℃	30 min	1 cycle
초기 변성(predenaturation)	95℃	15 min	1 cycle
변성(denaturation) 결합(annealing) 확장(extension)	94℃ 42℃ 72℃	30 sec 30 sec 1 min	35 cycles
최종신장(post-elongation)	72℃	7 min	1 cycle
보관	4℃	∞	∞

(3) 로타바이러스 VP4, VP7 One-step RT-PCR(Reverse transcription-PCR)에 사용하는 프라이머는 표 4와 같다.

표 4. 로타바이러스 One-step RT-PCR(Reverse transcription-PCR) 프라이머 염기서열

Target	Primer	Sequence(5'→3')
VP4	VP4F-M	TGG CTT CGC TCA TTT ATA GAC A
	Con2	ATT TCG GAC CAT TTA TAA CC
VP7	Beg-9	ATG TAT GGT ATT GAA TAT ACC AC
	End-9	AAC TTG CCA CCA TTT TTT CC

나) VP4, VP7 One-step RT-PCR(Reverse transcription-PCR) 산물을 주형으로 하여 Multiplex PCR을 실시한다.

(1) VP4 PCR 조성조건은 표 5와 같이 1차 PCR산물 2 μL, PCR Premix 10 μL, 프라이머 VP4F-M 1 μL(20 pmol), 1T-1 1 μL(20 pmol), 2T-1 1 μL(20 pmol), 3T-1 1 μL(20 pmol), 4T-1 2 μL(20 pmol),  5T-1 1 μL(20 pmol), P[11] 1 μL(20 pmol)  증류수로 총 25 μL로 맞춘 후 Multiplex PCR을 실시한다.  PCR 반응조건은 표 6과 같이 95℃에서 5분간 DNA를 변성시키고 94℃ 30초, 42℃ 30초, 72℃ 30초를 1회로 하여 25회를 반응시킨 후 72℃에서 7분간 연장 반응시킨다.

(2) VP7 PCR 조성조건은 표 7과 같이 1차 PCR산물 2 μL, PCR premix 10 μL, 프라이머 End-9 1 μL(20 pmol), aBT1 1 1 μL(20 pmol), aCT2 1 μL(20 pmol), aET3 1 μL(20 pmol),  aDT4 1 μL(20 pmol), aAT8 1 μL(20 pmol), aFT9 1 μL(20 pmol), G10 1 μL(20 pmol) 증류수로 총 25 μL로 맞춘 후 Multiplex PCR을 실시한다. PCR 반응조건은 표 8과 같이 94℃에서 2분간 DNA를 변성시키고 94℃ 1분, 48℃ 2분, 68℃ 1분을 1회로 하여 30회를 반응시킨 후 68℃에서 7분간 연장 반응시킨다.

표 5. 로타바이러스 VP4 Multiplex PCR 반응액 조성

Component	Volume	Primer	Genotype
PCR Premix	10 μL	-	-
D.W.	6 μL	-	-
Forward primer(20pmol)	각 1 μL	1T-1 2T-1 3T-1 4T-1 5T-1 P[11]	P1A[8] P1B[4] P2A[6] P3[9] P4[10] P[11]
Reverse primer(20pmol)	1 μL	VP4F-M	-
1st PCR Product	2 μL	-	-
Total	25 μL	-	-

표 6. 로타바이러스 VP4 Multiplex PCR 반응조건 및 온도

	온도	시간	Cycle
초기 변성(predenaturation)	95℃	5 min	1 cycle
변성(denaturation) 결합(annealing) 확장(extension)	94℃ 42℃ 72℃	30 sec 30 sec 30 sec	25 cycles
최종신장(post-elongation)	72℃	7 min	1 cycle
보관	4℃	∞	∞

표 7. 로타바이러스 VP7 Multiplex PCR 반응액 조성

Component	Volume	Primer	Genotype
PCR Premix	10 μL	-	-
D.W.	5 μL	-	-
Forward primer(20pmol)	각 1 μL	aBT1 aCT2 aET3 aDT4 aAT8 aFT9 G10	G1 G2 G4 G4 G8 G9 G10
Reverse primer(10pmol)	1 μL	End-9(R)	-
1st PCR Product	2 μL	-	-
Total	25 μL	-	-

	온도	시간	Cycle
초기 변성(predenaturation)	94℃	2 min	1 cycle
변성(denaturation) 결합(annealing) 확장(extension)	94℃ 48℃ 68℃	1 min 2 min 1 min	30 cycles
최종신장(post-elongation)	68℃	7 min	1 cycle
보관	4℃	∞	∞

표 8. 로타바이러스 VP7 Multiplex PCR 반응조건 및 온도

(3) 로타바이러스 VP4, VP7 Multiplex PCR에 사용하는 프라이머는 표 9와 같다.

표 9. 로타바이러스 VP4, VP7 Multiplex PCR 프라이머 염기서열

Target	Primer	Sequence(5'→3')
VP4	VP4F-M(F)	TGG CTT CGC TCA TTT ATA GAC A
	1T-1(R)	TCT ACT GGR TTR ACN TGC
	2T-1(R)	CTA TTG TTA GAG GTT AGA GTC
	3T-1(R)	TGT TGA TTA GTT GGA TTC AA
	4T-1(R)	TGA GAC ATG CAA TTG GAC
	5T-1(R)	ATC ATA GTT AGT AGT CGG
	P[11](R)	GTA AAC ATC CAG AAT GTG
VP7	End-9(R)	AAC TTG CCA CCA TTT TTT CC
	aBT1(F)	CAA GTA CTC AAA TCA ATG ATG G
	aCT2(F)	CAA TGA TAT TAA CAC ATT TTC TGT G
	aET3(F)	ACG AAC TCA ACA CGA GAG G
	aDT4(F)	CGT TTC TGG TGA GGA GTT G
	aAT8(F)	GTC ACA CCA TTT GTA AAT TCG
	aFT9(F)	CTT GAT GTG ACT AYA AAT AC
	G10(F)	ATG TCA GAC TAC ARA TAC TGG

(4) PCR 반응 종료 후 PCR 증폭 반응액 5 μL를 전기영동 완충액(gel loading buffer) 1 μL와 혼합한 다음 젤(gel)의 각 홈에 검체를 조심스럽게 넣고 나머지 한 홈에 PCR 증폭산물의 크기를 식별하기에 적당한 표식 DNA(marker DNA) 7 μL를 넣는다. 1.5% 아가로스 젤(agarose gel) 상에서 100V로 전기영동한 후 Ethidium Bromide(EtBr) 염색액(10 mg/mL)으로 30분간 염색한 후 증류수로 10분간 탈색하고 자외선 조사기(UV transilluminator)로 조사하여 증폭된 DNA 밴드를 관찰한다.

다) 1차 결과 확인

(1) VP4, VP7 PCR 증폭 반응액을 전기영동하여 표 10과 비교하여 PCR 증폭산물의 크기가 확인되면 로타바이러스로 일차 확인한다.

표 10.  VP4, VP7 PCR 증폭 크기

VP4
P-genotype	Primer	PCR 산물크기(bp)
P1A[8]	1T-1	345
P1B[4]	2T-2	483
P2A[6]	3T-1	267
P3[9]	4T-1	391
P4[10]	5T-1	583
P[11]	P[11]	312

VP7
G-genotype	Primer	PCR 산물크기(bp)
G1	aBT1	618
G2	aCT2	521
G3	aET3	682
G4	aDT4	452
G8	aAT8	754
G9	aFT9	179
G10	G10	266

(2) 만일 음성대조군(negative control)에서 PCR 밴드가 확인 될 경우 등은 재시험을 실시해야한다(표 11 참고).

(3) 로타바이러스가 일차 확인된 경우 최종 확인을 위하여 아가로스 젤(agarose gel)상에서 해당부위를 절취하여 PCR 산물을 정제한 후 염기서열(DNA sequencing)을 분석하여 최종 판정한다.

표 11. 로타바이러스 PCR 결과판정(예시)

	추출 RNA(시료)	음성대조군	1차 판정
1	+	-	PCR 검출
	+
2	+	-	PCR 검출
	-
3	+	+	재 실험
	+
4	-	-	PCR 불검출
	-

+ : 로타바이러스 PCR 밴드 확인됨,   - : 밴드가 확인되지 않음

라) 최종 검출 판정

(1) 염기서열 분석(DNA sequencing)을 위하여 다)의 (3)에서 정제된 DNA 1 μL를 주형으로 VP4이나 VP7 Multiplex PCR 증폭에 사용한 프라이머를 사용한다.

(2) 염기서열 분석(sequencing) 반응을 위한 혼합 조건은 각 유전자형 Multiplex 프라이머(primer, 1 pmol)를 독립된 각각의 튜브에 2 μL, dye-terminator 2 μL, 정제 DNA 2 μL를 첨가하여 증류수로 최종 10 μL가 되도록 하고 96℃에서 1분간 DNA를 변성시킨 후, 96℃에서 10초간, 50℃에서 5초간, 60℃에서 4분간을 1회로 하여 25회 반응시킨 다음 60℃에서 10분간 연장반응을 시킨다.

(3) PCR 산물은 염기서열 분석(DNA sequencing)하되 2종 이상의 유전자가 혼합되어 있는 경우에는 클로닝 염기서열 분석(Cloning DNA sequencing)을 재실시 한다. 염기서열 분석(DNA sequencing)에 의해 결정된 염기서열은 로타바이러스 유전자 데이터베이스(Referecne sequence 및 NCBI blast)와 비교하여 로타바이러스로 확인되었을 경우 검출된 것으로 최종 확인한다.

4.29 식품용수 등의 아스트로바이러스

가. 시약 및 시액

1) 2% 티오황산나트륨(Sodium thiosulfate: Na2S2O3) 용액

4,800 mL의 증류수에 티오황산나트륨 100 g을 녹여 최종 5,000 mL의 용액을 제조하고 121℃, 15분간 고압증기 멸균한다.

2) 1M 염산(HCl) 용액

1M 염산(HCl) 용액은 식품용수 채수 시 검체의 pH를 조정하는데 사용한다.

3) 1.5% Beef extract(desiccated powder) 용액

1,900 mL의 증류수에 Beef extract 분말 30 g과 glycine 7.5 g(최종농도 = 0.05 M)을 넣고 1M NaOH를 이용하여 pH 9.5로 조정한 후 최종 2 L로 제조하고 121℃, 15분간 고압증기 멸균한다. Beef extract 용액은 4℃에서 일주일간 혹은 -20℃에서 장기간동안 보관할 수 있다.

4) 0.15 M 인산일수소나트륨, 7수화물(Sodium phosphate, dibasic, (Na2HPO4  7H2O)) 용액

950 mL의 증류수에 Sodium phosphate 40.2 g을 넣고 1M  NaOH를 이용하여 pH 9.5로 조정한 후 최종 1 L로 제조하고 121℃, 15분간 고압증기 멸균한다.

5) 1M 수산화나트륨(NaOH) 용액

400 mL의 증류수에 20 g의 수산화나트륨을 넣고 최종 500 mL로 제조하여 수산화나트륨 용액을 준비한다. 수산화나트륨 용액은 상온에서 수개월 동안 보관할 수 있다.

6) 바이러스 유전자 추출 키트(Viral RNA Mini Kits)

시판되는 바이러스 RNA 추출 키트(kit)를 사용한다.

※ 재현성 및 검출효율 등을 고려하여 QIAGEN-Viral RNA Mini Kits 또는 동등 이상의 제품사용 가능

나. 장치 및 기구

1) 검체 채수과정

가) 표준필터장치：식품용수 1,500∼1,800 L을 채수하는 장치

구성 : 용수 유입구, 단일주입기, 유량조절밸브, 압력게이지, 탈리액 주입구, 양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter), 카트리지 하우징(cartridge housing), 탈리액 유출구, 유량계, 용수 유출구

※ 양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter) : 1-MDS, NanoCeram 또는 이와 동등한 것

나) 휴대용 pH 측정기：식품용수의 수소이온농도를 측정한다.

다) 휴대용 탁도 측정기：식품용수의 혼탁도를 측정한다.

라) 휴대용 염소 농도 측정기：식품용수의 잔류염소농도를 측정한다.

마) 휴대용 아이스박스：식품용수 채수 후 양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter)를 운반하기 위해 사용한다.

바) 상업용 얼음팩：양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter) 운반 시 냉장상태 유지용으로 사용한다.

사) 기타：공구상자, 2 L 멸균 비커, 멸균된 알루미늄박, 클램프, 바이러스시료 검체기록부, 멸균장갑, 수은온도계, 멸균 메스실린더, 채수용 호스

ⓐ 용수 유입구 ⓑ 단일주입기 ⓒ 유량조절밸브 ⓓ 압력게이지 ⓔ 탈리액 주입구 ⓕ 감압단추 ⓖ 양전하 카트리지 필터 ⓗ 카트리지 하우징 ⓘ 탈리액 유출구 ⓙ 유량계 ⓚ 용수 유출구

《표준필터장치》

2) 바이러스 탈리과정

가) 연동정량펌프：1.5% 양전하 카트리지 필터로 유입시켜 흡착된 바이러스를 탈리하기 위한 장치

나) 연동정량펌프 탈리액 유입용 호스, 탈리액 유출용 호스

다) 자석교반기 및 자석교반 막대

라) 하우징 거치대, 탈리액 유입구, 탈리액 유출구, 압력게이지

3) 바이러스 농축과정

가) 원심분리기(4 ℃, 2,500∼10,000 G)

나) 원심분리용기(50∼500 mL 용량)

다) 0.22 μm 주사기 필터(30 mL 용량)

다. 시험방법

1) 식품용수 채수

채수할 때는 멸균된 장갑을 착용하여 바이러스가 오염되지 않게 주의하고 오염이 될 수 있는 환경요인들을 피하여야 한다. 멸균된 장갑이 사람의 피부나 오염 가능성이 있는 장치, 부품에 접촉이 되었을 경우 장갑을 바꿔 착용한다(예：수도꼭지나 다른 환경요소 표면).

가) 채수하려는 검체의 배출구(수도꼭지 등)를 2～3분 정도 열고 식품용수를 흘려보낸다. 배출구에 채수호스를 장착 시 누수가 되지 않도록 클램프를 이용하여 단단히 연결하고 탁도가 균일할 때까지 흘려보낸 후 배출구를 잠근다.

나) 염소계소독제(예, HOCl 등)나 불꽃버너를 이용하여 배출구(수도꼭지 등)를 살균 또는 가열한다.

다) 채수용 호스의 알루미늄박을 제거한 후 채수 할 배출구에 연결하고 표준필터장치 용수 유입구(ⓐ)에 호스를 연결한다. 이 단계에서 양전하 카트리지 필터(ⓖ)는 연결하지 않는다.

라) 천천히 배출구를 열어 압력게이지가 200 kPa(30 PSI)가 넘지 않도록 배출구를 조절하고 76 L(20 gal)의 식품용수를 흘려보낸다.

마) 식품용수 76 L를 흘려 보낸 후 일부를 2 L 멸균 비커에 받아 용수의 탁도, pH, 온도, 염소농도를 각 각 측정하여 검체번호, 채수위치, 채수자의 이름과 함께 바이러스 검체채수기록부에 기록한다. pH 측정기는 사용 전 보정(calibration) 한다.

바) 용수 배출구(수도꼭지 등)를 잠그고 검체가 다음의 조건에 해당되어 부가장치의 연결이 필요한지의 여부를 결정하여 연결한다.

(1) pH 8이상일 경우 멸균된 튜브로 단일주입기(ⓑ)와 1 M 염산 용액이 담긴 메스실린더를 연결하고, 배출구(수도꼭지 등)를 다시 열어 용수의 pH가 6.5～7.5가 되도록 단일 주입기를 통해 1 M 염산 용액을 흘려보낸다. 용수유출구(ⓚ)로 흘러나온 용수의 pH를 측정해 바이러스 검체 채수기록부에 기록한다.

(2) 잔류염소 제거를 위해 위와 같이 단일주입기를 연결하여 식품용수 3.8 L(1 gal) 당 2% 티오황산나트륨 용액 10 mL이 주입되도록 한다.

* (1)와 (2)번이 모두 해당할 경우 이중주입기를 연결하여 사용한다.

사) 바이러스검체 채수기록부에 검체 채취일, 시작 시간, 유량계의 초기 수치를 기록한다.

아) 알루미늄박을 제거한 양전하 카트리지 필터를 탈리액 주입구(ⓔ)와 유출구(ⓘ) 사이에 연결한다.

자) 용수를 천천히 흐르게 하면서 카트리지 하우징 상단의 감압단추(ⓕ, vent button)를 눌러 내부공기가 완전히 빠지도록 한 후, 수도꼭지를 완전히 열어 준다.

차) 압력게이지가 200 kPa(30 PSI) 이하로 유지되도록 유량조절 밸브를 조정하고 식품용수 1,500～1,800 L를 통과시킨 후, 용수 배출구(수도꼭지 등)를 잠근다.

카) 바이러스 검체 채수기록부에 검체채취 종료일, 종료 시간, 유량계의 최종 수치 등을 기록한다.

타) 표준필터장치로부터 카트리지 하우징(ⓗ)을 분리하고 양전하 카트리지 필터를 거꾸로 하여 남은 물을 버린 후 하우징 양끝의 연결된 개구부를 멸균된 알루미늄박으로 싼다.

파) 양전하 카트리지 필터를 아이스박스에 담고 얼음팩 등을 사용하여 냉장상태(냉동시켜서는 아니 된다)로 유지하여 즉시 실험실로 운반한다.

2) 바이러스 탈리과정

가) 냉장 보관하여 운반한 필터는 채수 시작 시간부터 24시간 내에 실험실에서 바이러스 탈리 시험을 실시하여야 한다. 다만, 부득이한 경우로 인해 24시간 내에 탈리시험이 불가할 경우 최대 72시간이 넘지 않도록 한다.

나) 탈리용 거치대에 카트리지 하우징을 장착한 후 유량조절 밸브를 모두 닫는다.

다) 탈리액 주입구에 연동정량펌프 호스를 연결한 후 연동정량펌프와 1.5% Beef extract 용액이 채워져 있는 유리병에 호스를 차례로 연결하되, 1-MDS 필터는 1 L, NanoCeram 필터에는 0.5 L의 1.5% Beef extract 용액을 사용한다.

라) 탈리액 유출구에 유출용 호스를 연결하여 1.5% Beef extract 용액이 들어 있는 유리병에 넣고 탈리액 유출구를 닫는다.

마) 연동정량펌프를 가동하여양전하 카트리지 필터 하우징 안으로 1.5% Beef extract 용액이 양전하 카트리지 필터 내에 완전히 차도록 한 후 감압단추를 통해 1.5% Beef extract 용액이 넘쳐 흘러나오기 시작하면 감압단추에서 손을 떼고, 연동정량펌프 가동을 멈춘 후 5분간 정치한다.

※ 감압단추는 탈리액이 양전하 카트리지 필터 안으로 가득 채워질 때까지 눌러준다.

바) 탈리액 유출구를 열고 연동정량펌프를 다시 가동한 후 하우징에 채워져 있는 1.5% Beef extract 용액이 서서히 필터를 통과하도록 한다. 통과한 완충액은 1.5% Beef extract 용액이 들어있던 유리병에 수집한다. 탈리액을 회수할 때는 거품이 없도록 주의하여야 한다.

※ 연동정량펌프 대신 양압펌프와 압력통을 사용하여 탈리과정을 진행할 수도 있다.

사) 유리병에 수집된 탈리액은 라)～바)의 과정을 2회 반복한다.

아) 최종 탈리액은 1 M 염산 용액으로 pH를 7.0～7.5 사이로 조절하고 멸균된 메스실린더를 사용하여 부피를 기록한다.

자) 탈리액은 24시간 이내에 농축시험이 가능할 경우 4℃에서 보관하며, 농축 시험을 즉시 시행하기 어려울 때에는 -70℃에서 보관한다.

3) 바이러스 농축과정

가) 최종 탈리액을 교반기에서 혼합하면서 1 M 염산용액으로 pH를 3.5±0.1로 조절한 후, 실온에서 30분간 천천히 섞는다.

나) 침전물이 생기면 탈리액을 멸균한 원심분리용기에 옮겨 원심분리한다(2,500 G 15분, 4℃).

다) 원심분리 후, 상등액을 제거하고 남은 침전물에 0.15 M sodium phosphate 완충액(pH 9.0～9.5)을  20～30 mL 넣어 완전히 부유 시킨 후 실온에 10분간 방치한다.

라) 부유시킨 용액을 원심분리한다(7,000 G, 10분, 4℃).

마) 상등액을 취해 1 M 염산용액으로 pH 7.0～7.5로 조절한다.

바) 미생물오염을 방지하기 위해 30 mL 주사기를 이용하여 상등액을 0.22 μm 주사기 필터로 여과한다. 검체 중의 바이러스가 필터에 흡착되는 것을 방지하기 위하여 사전에 0.22 μm 주사기 필터에 10～20 mL의 1.5% Beef extract 용액(pH 7.0～7.5)을 통과시킨다.

사) 최종 농축 검체량(FCSV=final concentrated sample volume)을 기록하고 검체를 24시간 이내에 분석할 경우는 4℃에 보관하고 나머지는 분석 전까지 -70℃에 보관한다.

아) 최종 농축검체 20～30 mL는 바이러스 유전자 추출을 위한 검체로 사용한다.

4) 바이러스 유전자 추출 과정

시판되는 바이러스 RNA 추출 키트(kit)를 사용하며, 제조사가 제시하는 적절한 실험법에 따라 실시한다.

※ 재현성 및 검출효율 등을 고려하여 QIAGEN-Viral RNA Mini Kits 또는 동등 이상의 제품이 사용이 가능하며, 또한 자동유전자 추출장치를 사용할 경우에도 바이러스 RNA 추출 키트를 사용하여 바이러스 유전자를 추출할 수 있다.

가) 바이러스 유전자 추출 시 검체와 동일한 과정으로 음성대조군(negative control)을 사용하여 유전자를 추출하며 검체의 경우 시험 진행 중 오염 여부를 확인하기 위해 2개의 RNA를 추출한다.

나) 검체 농축액과 음성대조군 각 280 μL에 AVL 완충액(guanidine thiocyanate 함유) 1,120 μL를 각각 혼합하여 실온에서 10분 동안 방치한 후 가볍게 원심분리기를 이용하여 원심분리(spin-down)한다.

다) 여기에 95～100% 에탄올 1,120 μL을 넣어 혼합한 후 가볍게 원심분리(spin-down)한다.

라) 혼합액 630 μL을 소량 원심(Mini spin) 컬럼으로 옮겨 6,000 G에서 1분간 원심분리하고 컬럼을 새로운 회수용(collection) 튜브로 옮긴 다음 남은 혼합액을 630 μL씩 동일한 방법으로 컬럼에 첨가하여 원심분리한다.

마) 소량 원심(Mini spin) 컬럼을 새로운 회수용(collection) 튜브로 옮겨 AW1 완충액(guanidine hydrochloride 함유) 500 μL을 넣고 6,000 G로 1분간 원심분리 후 컬럼을 새로운 회수용(collection) 튜브로 옮긴다.

바) AW2 완충액 500 μL을 넣고 20,000 G로 3분간 원심분리한 후 컬럼을 새로운 1.5 mL 회수용(collection) 튜브로 옮긴다.

사) AVE 완충액(sodium azide 함유) 60 μL를 넣고 6,000 G로 1분간 원심분리하여 다음의 RT-PCR(Reverse transcription -Polymerase chain reaction)을 수행하기 위한 주형(template)으로 사용한다.

5) 아스트로바이러스 유전자 PCR 과정 및 결과판정

RT-PCR(Reverse transcription -PCR) 과정에서는 아스트로바이러스를 인위적으로 조합하여 합성한 RNA 등을 PCR 양성대조군으로 사용할 수 있다.

가) One-step RT-PCR(Reverse transcription -PCR) 방법은 아래와 같이 수행한다.

(1) PCR 조성조건은 Mastermix(2X) 12.5 μL, Reverse transcriptase(50unit/μL) 0.5 μL, 프라이머(Mon 269, Mon 270)는 각 2 μL, 추출 RNA 2 μL를 첨가하여 증류수로 총 25 μL로 맞추고 반응시킨다.

(2) PCR 반응조건은 48℃에서 40분, 94℃에서 3분 DNA를 변성시키고, 94℃ 30초, 52℃ 30초, 72℃ 1분 30초를 1회로 하여 35회 반응시킨 후, 68℃에서 5분간 연장 반응시킨다.

표 1. 아스트로바이러스 One-step RT-PCR(Reverse transcription -PCR) 반응액 조성

Component	Volume	Primer
Mastermix(2X)	12.5 μL	-
Reverse transcriptase (50unit/μL)	0.5 μL	-
D.W.	6 μL	-
Forward primer(10 pmol)	2 μL	Mon 269
Reverse primer(10 pmol)	2 μL	Mon 270
Extracted RNA	2 μL	-
Total	25 μL

표 2. 아스트로바이러스 One-step RT-PCR(Reverse transcription -PCR) 반응조건 및 온도

	온도	시간	cycle
cDNA 합성(cDNA synthesis) 초기 변성(predenaturation)	48℃ 94℃	40 min 3 min	1 cycle
변성(denaturation) 결합(annealing) 확장(extension)	94℃ 52℃ 72℃	30 sec 30 sec 1 min 30sec	35 cycles
최종신장(post-elongation)	68℃	5 min	1 cycle
보관	4℃	∞	∞

primer	Sequence(5'→3')	Application	PCR Size(bP)
Mon 269	CAA CTC AGG AAA CAG GGT GT	One-step RT- PCR/Sequencing	449
Mon 270	TCA GAT GCA TTG TCA TTG GT	One-step RT- PCR/Sequencing

표 3. 아스트로바이러스 One-step RT-PCR(Reverse transcription -PCR) 프라이머 염기서열

나) 1차 결과 확인

(1) 아가로스 젤(agarose gel)상에서 시료에 증폭산물이 449 bp 경우 아스트로바이러스로 일차 확인한다.

(2) 만일 음성대조군(negative control)에서 PCR 밴드가 확인 될 경우 등은 재시험을 실시해야한다(표 4 참고).

(3) 아스트로바이러스가 일차 확인된 경우 최종 확인을 위하여 아가로스 젤(agarose gel)상에서 해당부위를 절취하여 PCR 산물을 정제한 후 염기서열(DNA sequencing)을 분석하여 최종 판정한다.

표 4. 아스트로바이러스 PCR 결과판정(예시)

	추출 RNA(시료)	음성대조군	1차 판정
1	+	-	PCR 검출
	+
2	+	-	PCR 검출
	-
3	+	+	재 실험
	+
4	-	-	PCR 불검출
	-

+ : 아스트로바이러스 PCR 밴드 확인됨, - : 밴드가 확인되지 않음

다) 최종 검출 판정

(1) 염기서열 분석(DNA sequencing)을 위하여 다)의 (3)에서 정제된 DNA 1 μL를 주형으로 바이러스 유전형 및 진행방향에 따라 Mon 269 및 Mon 270의 프라이머를 사용한다.

(2) 염기서열 분석(sequencing) 반응을 위한 혼합 조건은 각 프라이머(primer, 1 pmol)를 독립된 각각의 튜브에 2 μL, dye-terminator 2 μL, 정제 DNA 2 μL를 첨가하여 증류수로 최종 10 μL가 되도록 하고 96℃에서 1분간 DNA를 변성시킨 후, 96℃에서 10초간, 50℃에서 5초간, 60℃에서 4분간을 1회로 하여 25회 반응시킨 다음 60℃에서 10분간 연장반응을 시킨다.

(3) PCR 산물은 염기서열 분석(DNA sequencing)하되 2종 이상의 유전자가 혼합되어 있는 경우에는 클로닝 염기서열 분석(Cloning DNA sequencing)을 재실시 한다. 염기서열 분석(DNA sequencing)에 의해 결정된 염기서열은 아스트로바이러스 유전자 데이터베이스(Referecne sequence 및 NCBI blast)와 비교하여 아스트로바이러스로 확인되었을 경우 검출된 것으로 최종 확인한다.

4.30 식품용수 등의 장관아데노바이러스

가. 시약 및 시액

1) 2% 티오황산나트륨(Sodium thiosulfate: Na2S2O3) 용액

4,800 mL의 증류수에 티오황산나트륨 100 g을 녹여 최종 5,000 mL의 용액을 제조하고 121℃, 15분간 고압증기 멸균한다.

2) 1M 염산(HCl) 용액

1M 염산(HCl) 용액은 식품용수 채수 시 검체의 pH를 조정하는데 사용한다.

3) 1.5% Beef extract(desiccated powder) 용액

1,900 mL의 증류수에 Beef extract 분말 30 g과 glycine 7.5 g(최종농도 = 0.05 M)을 넣고 1M NaOH를 이용하여 pH 9.5로 조정한 후 최종 2 L로 제조하고 121℃, 15분간 고압증기 멸균한다. Beef extract 용액은 4℃에서 일주일간 혹은 -20℃에서 장기간동안 보관할 수 있다.

4) 0.15 M 인산일수소나트륨, 7수화물(Sodium phosphate, dibasic, (Na2HPO4  7H2O)) 용액

950 mL의 증류수에 Sodium phosphate 40.2 g을 넣고 1M  NaOH를 이용하여 pH 9.5로 조정한 후 최종 1 L로 제조하고 121℃, 15분간 고압증기 멸균한다.

5) 1M 수산화나트륨(NaOH) 용액

400 mL의 증류수에 20 g의 수산화나트륨을 넣고 최종 500 mL로 제조하여 수산화나트륨 용액을 준비한다. 수산화나트륨 용액은 상온에서 수개월 동안 보관할 수 있다.

6) 바이러스 유전자 추출 키트

시판되는 바이러스 DNA 추출 키트(kit)를 사용하며, 제조사가 제시하는 적절한 실험법에 따라 실시한다.

※ 또한 자동유전자 추출장치를 사용할 경우에도 바이러스 추출 키트를 사용하여 바이러스 유전자를 추출할 수 있다.

나. 장치 및 기구

1) 검체 채수과정

가) 표준필터장치：식품용수 1,500∼1,800 L을 채수하는 장치

구성 : 용수 유입구, 단일주입기, 유량조절밸브, 압력게이지, 탈리액 주입구, 양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter), 카트리지 하우징(cartridge housing), 탈리액 유출구, 유량계, 용수 유출구

※ 양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter) : 1-MDS, NanoCeram 또는 이와 동등한 것

나) 휴대용 pH 측정기：식품용수의 수소이온농도를 측정한다.

다) 휴대용 탁도 측정기：식품용수의 혼탁도를 측정한다.

라) 휴대용 염소 농도 측정기：식품용수의 잔류염소농도를 측정한다.

마) 휴대용 아이스박스：식품용수 채수 후 양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter)를 운반하기 위해 사용한다.

바) 상업용 얼음팩：양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter) 운반 시 냉장상태 유지용으로 사용한다.

사) 기타：공구상자, 2 L 멸균 비커, 멸균된 알루미늄박, 클램프, 바이러스시료 검체기록부, 멸균장갑, 수은온도계, 멸균 메스실린더, 채수용 호스

ⓐ 용수 유입구 ⓑ 단일주입기 ⓒ 유량조절밸브 ⓓ 압력게이지 ⓔ 탈리액 주입구 ⓕ 감압단추 ⓖ 양전하 카트리지 필터 ⓗ 카트리지 하우징 ⓘ 탈리액 유출구 ⓙ 유량계 ⓚ 용수 유출구

《표준필터장치》

2) 바이러스 탈리과정

가) 연동정량펌프：1.5% 양전하 카트리지 필터로 유입시켜 흡착된 바이러스를 탈리하기 위한 장치

나) 연동정량펌프 탈리액 유입용 호스, 탈리액 유출용 호스

다) 자석교반기 및 자석교반 막대

라) 하우징 거치대, 탈리액 유입구, 탈리액 유출구, 압력게이지

3) 바이러스 농축과정

가) 원심분리기(4 ℃, 2,500∼10,000 G)

나) 원심분리용기(50∼500 mL 용량)

다) 0.22 μm 주사기 필터(30 mL 용량)

다. 시험방법

1) 식품용수 채수

채수할 때는 멸균된 장갑을 착용하여 바이러스가 오염되지 않게 주의하고 오염이 될 수 있는 환경요인들을 피하여야 한다. 멸균된 장갑이 사람의 피부나 오염 가능성이 있는 장치, 부품에 접촉이 되었을 경우 장갑을 바꿔 착용한다(예：수도꼭지나 다른 환경요소 표면).

가) 채수하려는 검체의 배출구(수도꼭지 등)를 2～3분 정도 열고 식품용수를 흘려보낸다. 배출구에 채수호스를 장착 시 누수가 되지 않도록 클램프를 이용하여 단단히 연결하고 탁도가 균일할 때까지 흘려보낸 후 배출구를 잠근다.

나) 염소계소독제(예, HOCl 등)나 불꽃버너를 이용하여 배출구(수도꼭지 등)를 살균 또는 가열한다.

다) 채수용 호스의 알루미늄박을 제거한 후 채수 할 배출구에 연결하고 표준필터장치 용수 유입구(ⓐ)에 호스를 연결한다. 이 단계에서 양전하 카트리지 필터(ⓖ)는 연결하지 않는다.

라) 천천히 배출구를 열어 압력게이지가 200 kPa(30 PSI)가 넘지 않도록 배출구를 조절하고 76 L(20 gal)의 식품용수를 흘려보낸다.

마) 식품용수 76 L를 흘려 보낸 후 일부를 2 L 멸균 비커에 받아 용수의 탁도, pH, 온도, 염소농도를 각 각 측정하여 검체번호, 채수위치, 채수자의 이름과 함께 바이러스 검체채수기록부에 기록한다. pH 측정기는 사용 전 보정(calibration) 한다.

바) 용수 배출구(수도꼭지 등)를 잠그고 검체가 다음의 조건에 해당되어 부가장치의 연결이 필요한지의 여부를 결정하여 연결한다.

(1) pH 8이상일 경우 멸균된 튜브로 단일주입기(ⓑ)와 1 M 염산 용액이 담긴 메스실린더를 연결하고, 배출구(수도꼭지 등)를 다시 열어 용수의 pH가 6.5～7.5가 되도록 단일 주입기를 통해 1 M 염산 용액을 흘려보낸다. 용수유출구(ⓚ)로 흘러나온 용수의 pH를 측정해 바이러스 검체 채수기록부에 기록한다.

(2) 잔류염소 제거를 위해 위와 같이 단일주입기를 연결하여 식품용수 3.8 L(1 gal) 당 2% 티오황산나트륨 용액 10 mL이 주입되도록 한다.

* (1)와 (2)번이 모두 해당할 경우 이중주입기를 연결하여 사용한다.

사) 바이러스검체 채수기록부에 검체 채취일, 시작 시간, 유량계의 초기 수치를 기록한다.

아) 알루미늄박을 제거한 양전하 카트리지 필터를 탈리액 주입구(ⓔ)와 유출구(ⓘ) 사이에 연결한다.

자) 용수를 천천히 흐르게 하면서 카트리지 하우징 상단의 감압단추(ⓕ, vent button)를 눌러 내부공기가 완전히 빠지도록 한 후, 수도꼭지를 완전히 열어 준다.

차) 압력게이지가 200 kPa(30 PSI) 이하로 유지되도록 유량조절 밸브를 조정하고 식품용수 1,500～1,800 L를 통과시킨 후, 용수 배출구(수도꼭지 등)를 잠근다.

카) 바이러스 검체 채수기록부에 검체채취 종료일, 종료 시간, 유량계의 최종 수치 등을 기록한다.

타) 표준필터장치로부터 카트리지 하우징(ⓗ)을 분리하고 양전하 카트리지 필터를 거꾸로 하여 남은 물을 버린 후 하우징 양끝의 연결된 개구부를 멸균된 알루미늄박으로 싼다.

파) 양전하 카트리지 필터를 아이스박스에 담고 얼음팩 등을 사용하여 냉장상태(냉동시켜서는 아니 된다)로 유지하여 즉시 실험실로 운반한다.

2) 바이러스 탈리과정

가) 냉장 보관하여 운반한 필터는 채수 시작 시간부터 24시간 내에 실험실에서 바이러스 탈리 시험을 실시하여야 한다. 다만, 부득이한 경우로 인해 24시간 내에 탈리시험이 불가할 경우 최대 72시간이 넘지 않도록 한다.

나) 탈리용 거치대에 카트리지 하우징을 장착한 후 유량조절 밸브를 모두 닫는다.

다) 탈리액 주입구에 연동정량펌프 호스를 연결한 후 연동정량펌프와 1.5% Beef extract 용액이 채워져 있는 유리병에 호스를 차례로 연결하되, 1-MDS 필터는 1 L, NanoCeram 필터에는 0.5 L의 1.5% Beef extract 용액을 사용한다.

라) 탈리액 유출구에 유출용 호스를 연결하여 1.5% Beef extract 용액이 들어 있는 유리병에 넣고 탈리액 유출구를 닫는다.

마) 연동정량펌프를 가동하여 양전하 카트리지 필터 하우징 안으로 1.5% Beef extract 용액이 양전하 카트리지 필터 내에 완전히 차도록 한 후 감압단추를 통해 1.5% Beef extract 용액이 넘쳐 흘러나오기 시작하면 감압단추에서 손을 떼고, 연동정량펌프 가동을 멈춘 후 5분간 정치한다.

※ 감압단추는 탈리액이 양전하 카트리지 필터 안으로 가득 채워질 때까지 눌러준다.

바) 탈리액 유출구를 열고 연동정량펌프를 다시 가동한 후 하우징에 채워져 있는 1.5% Beef extract 용액이 서서히 필터를 통과하도록 한다. 통과한 완충액은 1.5% Beef extract 용액이 들어있던 유리병에 수집한다. 탈리액을 회수할 때는 거품이 없도록 주의하여야 한다.

※ 연동정량펌프 대신 양압펌프와 압력통을 사용하여 탈리과정을 진행할 수도 있다.

사) 유리병에 수집된 탈리액은 라)～바)의 과정을 2회 반복한다.

아) 최종 탈리액은 1 M 염산 용액으로 pH를 7.0～7.5 사이로 조절하고 멸균된 메스실린더를 사용하여 부피를 기록한다.

자) 탈리액은 24시간 이내에 농축시험이 가능할 경우 4℃에서 보관하며, 농축 시험을 즉시 시행하기 어려울 때에는 -70℃에서 보관한다.

3) 바이러스 농축과정

가) 최종 탈리액을 교반기에서 혼합하면서 1 M 염산용액으로 pH를 3.5±0.1로 조절한 후, 실온에서 30분간 천천히 섞는다.

나) 침전물이 생기면 탈리액을 멸균한 원심분리용기에 옮겨 원심분리한다(2,500 G 15분, 4℃).

다) 원심분리 후, 상등액을 제거하고 남은 침전물에 0.15 M sodium phosphate 완충액(pH 9.0～9.5)을  20～30 mL 넣어 완전히 부유 시킨 후 실온에 10분간 방치한다.

라) 부유시킨 용액을 원심분리한다(7,000 G, 10분, 4℃).

마) 상등액을 취해 1 M 염산용액으로 pH 7.0～7.5로 조절한다.

바) 미생물오염을 방지하기 위해 30 mL 주사기를 이용하여 상등액을 0.22 μm 주사기 필터로 여과한다. 검체 중의 바이러스가 필터에 흡착되는 것을 방지하기 위하여 사전에 0.22 μm 주사기 필터에 10～20 mL의 1.5% Beef extract 용액(pH 7.0～7.5)을 통과시킨다.

사) 최종 농축 검체량(FCSV=final concentrated sample volume)을 기록하고 검체를 24시간 이내에 분석할 경우는 4℃에 보관하고 나머지는 분석 전까지 -70℃에 보관한다.

아) 최종 농축검체 20～30 mL는 바이러스 유전자 추출을 위한 검체로 사용한다.

4) 바이러스 유전자 추출 과정

시판되는 바이러스 DNA 추출 키트(kit)를 사용하며, 제조사가 제시하는 적절한 실험법에 따라 실시한다.

※ 또한 자동유전자 추출장치를 사용할 경우에도 바이러스 추출 키트를 사용하여 바이러스 유전자를 추출할 수 있다.

가) 바이러스 유전자 추출 시 검체와 동일한 과정으로 음성대조군(negative control)을 사용하여 유전자를 추출하며 검체의 경우 시험 진행 중 오염 여부를 확인하기 위해 2개의 DNA를 추출한다.

나) 검체 농축액과 음성대조군 각 300 μL에 Lysis-Binding solution buffer 600 μL를 넣어 혼합하고 가볍게 원심분리한 후 실온에서 5분 동안 방치한다.

다) 여기에 Magnetic bead를 40 μL를 넣어 혼합한 후 상온에서 10분간 방치한다.

라) Magnetic trapper에 튜브를 장착한 후 상층액을 모두 제거한다.

마) Magnetic trapper에서 튜브를 꺼내 Washing 1 solution 600 μL를 넣고 세척한 후 다시 trapper에 장착하여 상층액을 모두 제거한다.

바) Trapper에서 튜브를 꺼내어 Washing 2 solution 600 μL를 첨가하여 세척하고 다시 trapper에 장착하여 상층액을 모두 제거한다.

사) Trapper에서 튜브를 꺼내어 Washing 3 solution 600 μL를 첨가하여 세척하고 다시 trapper에 장착하여 상층액을 모두 제거한다.

아) Elution buffer 160 μL를 넣고 5분간 실온 방치한다.

자) Trapper에서 튜브를 꺼내어 60℃에서 10분간 방치한 후 다시 trapper에 장착하여 상층액을 취하며 PCR을 수행하기 위한 주형(template)으로 사용한다.

5) 장관아데노바이러스 유전자 PCR 과정 및 결과판정

PCR(Polymerase chain reaction)과정에서는 장관아데노바이러스를 인위적으로 조합하여 합성한 DNA 등을 PCR 양성대조군으로 사용할 수 있다.

가) PCR 방법은 아래와 같이 수행한다.

(1) PCR 조성조건은 표 1과 같이 추출 DNA 5 μL, 10x 완충액(MgCl2 포함) 5 μL, dNTPs(10 mM) 4 μL, Taq DNA polymerase 1 μL, 프라이머(AD1, AD2)는 각 1 μL 첨가한 다음 최종 증류수로 총 50 μL로 맞춘 후 PCR을 실시한다.

(2) PCR 반응조건은 표 2와 같이 94℃에서 3분간 DNA를 변성시키고 94℃ 30초, 50℃ 30초, 72℃ 1분을 1회로 하여 35회를 반응시킨 후 72℃에서 5분간 연장 반응시킨다.

표 1. 장관아데노바이러스 PCR 반응액 조성

Component	Volume	Primer
dNTPs(10mM)	4 μL	-
10x Buffer(with MgCl2)	5 μL	-
D.W.	33 μL	-
Forward primer(10 pmol)	1 μL	AD1
Reverse primer(10 pmol)	1 μL	AD2
Taq DNA polymerase	1 μL	-
DNA	5 μL	-
Total	50 μL

표 2. 장관아데노바이러스 PCR 반응조건 및 온도

	온도	시간	cycle
초기 변성 (predenaturation)	94℃	3 min	1 cycle
변성(denaturation) 결합(annealing) 확장(extension)	94℃ 50℃ 72℃	30 sec 30 sec 1 min	35 cycles
최종신장(post-elongation)	72℃	5 min	1 cycle
보관	4℃	∞	∞

(3) PCR 반응 종료 후 PCR 증폭 반응액 5 μL를 전기영동 완충액(gel loading buffer) 1 μL와 혼합한 다음 젤(gel)의 각 홈에 검체를 조심스럽게 넣고 나머지 한 홈에 PCR 증폭산물의 크기를 식별하기에 적당한 표식 DNA(marker DNA) 7 μL를 넣는다. 1.5% 아가로스 젤(agarose gel) 상에서 100V로 전기영동한 후 Ethidium Bromide(EtBr) 염색액(10 mg/mL)으로 30분간 염색한 후 증류수로 10분간 탈색하고 자외선 조사기(UV transilluminator)로 조사하여 증폭된 DNA 밴드를 관찰한다.

(4) 장관아데노바이러스 유전자 증폭에 사용하는 프라이머는 표 3과 같다.

표 3. 장관아데노바이러스 PCR 프라이머 염기서열

Primer	Sequence(5'→3')	Application	PCR Size(bP)
AD1	TTC CCC ATG GCI CAY AAC AC	PCR/sequencing	482
AD2	CCC TGG TAK CCR TRT TGT A	PCR/sequencing

다) 1차 결과 확인

(1) 아가로즈 젤(agarose gel)상에서 시료에 PCR 밴드의 크기가 482 bp로 확인 될 경우 장관아데노바이러스로 일차 확인한다.

(2) 만일 음성대조군(negative control)에서 PCR 밴드가 확인 될 경우 등은 재시험을 실시해야한다(표 4 참고).

(3) 장관아데노바이러스가 일차 확인된 경우 최종 확인을 위하여 아가로스 젤(agarose gel)상에서 해당부위를 절취하여 PCR 산물을 정제한 후 염기서열(DNA sequencing)을 분석하여 최종 판정한다.

표 4. 장관아데노바이러스 PCR 결과판정(예시)

	추출 RNA(시료)	음성대조군	1차 판정
1	+	-	PCR 검출
	+
2	+	-	PCR 검출
	-
3	+	+	재 실험
	+
4	-	-	PCR 불검출
	-

+ : 장관아데노바이러스 PCR 밴드 확인됨, - : 밴드가 확인되지 않음

라) 최종 검출 판정

(1) 염기서열 분석(DNA sequencing)을 위하여 다)의 (3)에서 정제된 DNA 1 μL를 주형으로 AD1과 AD2 프라이머를 사용한다.

(2) 염기서열 분석(sequencing) 반응을 위한 혼합 조건은 각 유전자형 Semi-nested 프라이머(primer, 1 pmol)를 독립된 각각의 튜브에 2 μL, dye-terminator 2 μL, 정제 DNA 2 μL를 첨가하여 증류수로 최종 10 μL가 되도록 하고 96℃에서 1분간 DNA를 변성시킨 후, 96℃에서 10초간, 50℃에서 5초간, 60℃에서 4분간을 1회로 하여 25회 반응시킨 다음 60℃에서 10분간 연장반응을 시킨다.

(3) PCR 산물은 염기서열 분석(DNA sequencing)하되 2종 이상의 유전자가 혼합되어 있는 경우에는 클로닝 염기서열 분석(Cloning DNA sequencing)을 재실시 한다. 염기서열 분석(DNA sequencing)에 의해 결정된 염기서열은 장관아데노바이러스 유전자 데이터베이스(Referecne sequence 및 NCBI blast)와 비교하여 장관아데노바이러스로 확인되었을 경우 검출된 것으로 최종 확인한다.

4.31 식품용수 등의 사포바이러스

가. 시약 및 시액

1) 2% 티오황산나트륨(Sodium thiosulfate: Na2S2O3) 용액

4,800 mL의 증류수에 티오황산나트륨 100 g을 녹여 최종 5,000 mL의 용액을 제조하고 121℃, 15분간 고압증기 멸균한다.

2) 1M 염산(HCl) 용액

1M 염산(HCl) 용액은 식품용수 채수 시 검체의 pH를 조정하는데 사용한다.

3) 1.5% Beef extract(desiccated powder) 용액

1,900 mL의 증류수에 Beef extract 분말 30 g과 glycine 7.5 g(최종농도 = 0.05 M)을 넣고 1M NaOH를 이용하여 pH 9.5로 조정한 후 최종 2 L로 제조하고 121℃, 15분간 고압증기 멸균한다. Beef extract 용액은 4℃에서 일주일간 혹은 -20℃에서 장기간동안 보관할 수 있다.

4) 0.15 M 인산일수소나트륨, 7수화물(Sodium phosphate, dibasic, (Na2HPO4  7H2O)) 용액

950 mL의 증류수에 Sodium phosphate 40.2 g을 넣고 1M  NaOH를 이용하여 pH 9.5로 조정한 후 최종 1 L로 제조하고 121℃, 15분간 고압증기 멸균한다.

5) 1M 수산화나트륨(NaOH) 용액

400 mL의 증류수에 20 g의 수산화나트륨을 넣고 최종 500 mL로 제조하여 수산화나트륨 용액을 준비한다. 수산화나트륨 용액은 상온에서 수개월 동안 보관할 수 있다.

6) 바이러스 유전자 추출 키트(Viral RNA Mini Kits)

시판되는 바이러스 RNA 추출 키트(kit)를 사용한다.

※ 재현성 및 검출효율 등을 고려하여 QIAGEN-Viral RNA Mini Kits 또는 동등 이상의 제품사용 가능

나. 장치 및 기구

1) 검체 채수과정

가) 표준필터장치：식품용수 1,500∼1,800 L을 채수하는 장치

구성 : 용수 유입구, 단일주입기, 유량조절밸브, 압력게이지, 탈리액 주입구, 양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter), 카트리지 하우징(cartridge housing), 탈리액 유출구, 유량계, 용수 유출구

※ 양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter) : 1-MDS, NanoCeram 또는 이와 동등한 것

나) 휴대용 pH 측정기：식품용수의 수소이온농도를 측정한다.

다) 휴대용 탁도 측정기：식품용수의 혼탁도를 측정한다.

라) 휴대용 염소 농도 측정기：식품용수의 잔류염소농도를 측정한다.

마) 휴대용 아이스박스：식품용수 채수 후 양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter)를 운반하기 위해 사용한다.

바) 상업용 얼음팩：양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter) 운반 시 냉장상태 유지용으로 사용한다.

사) 기타：공구상자, 2 L 멸균 비커, 멸균된 알루미늄박, 클램프, 바이러스시료 검체기록부, 멸균장갑, 수은온도계, 멸균 메스실린더, 채수용 호스

ⓐ 용수 유입구 ⓑ 단일주입기 ⓒ 유량조절밸브 ⓓ 압력게이지 ⓔ 탈리액 주입구 ⓕ 감압단추 ⓖ 양전하 카트리지 필터 ⓗ 카트리지 하우징 ⓘ 탈리액 유출구 ⓙ 유량계 ⓚ 용수 유출구

《표준필터장치》

2) 바이러스 탈리과정

가) 연동정량펌프：1.5% 양전하 카트리지 필터로 유입시켜 흡착된 바이러스를 탈리하기 위한 장치

나) 연동정량펌프 탈리액 유입용 호스, 탈리액 유출용 호스

다) 자석교반기 및 자석교반 막대

라) 하우징 거치대, 탈리액 유입구, 탈리액 유출구, 압력게이지

3) 바이러스 농축과정

가) 원심분리기(4 ℃, 2,500∼10,000 G)

나) 원심분리용기(50∼500 mL 용량)

다) 0.22 μm 주사기 필터(30 mL 용량)

다. 시험방법

1) 식품용수 채수

채수할 때는 멸균된 장갑을 착용하여 바이러스가 오염되지 않게 주의하고 오염이 될 수 있는 환경요인들을 피하여야 한다. 멸균된 장갑이 사람의 피부나 오염 가능성이 있는 장치, 부품에 접촉이 되었을 경우 장갑을 바꿔 착용한다(예：수도꼭지나 다른 환경요소 표면).

가) 채수하려는 검체의 배출구(수도꼭지 등)를 2～3분 정도 열고 식품용수를 흘려보낸다. 배출구에 채수호스를 장착 시 누수가 되지 않도록 클램프를 이용하여 단단히 연결하고 탁도가 균일할 때까지 흘려보낸 후 배출구를 잠근다.

나) 염소계소독제(예, HOCl 등)나 불꽃버너를 이용하여 배출구(수도꼭지 등)를 살균 또는 가열한다.

다) 채수용 호스의 알루미늄박을 제거한 후 채수 할 배출구에 연결하고 표준필터장치 용수 유입구(ⓐ)에 호스를 연결한다. 이 단계에서 양전하 카트리지 필터(ⓖ)는 연결하지 않는다.

라) 천천히 배출구를 열어 압력게이지가 200 kPa(30 PSI)가 넘지 않도록 배출구를 조절하고 76 L(20 gal)의 식품용수를 흘려보낸다.

마) 식품용수 76 L를 흘려 보낸 후 일부를 2 L 멸균 비커에 받아 용수의 탁도, pH, 온도, 염소농도를 각 각 측정하여 검체번호, 채수위치, 채수자의 이름과 함께 바이러스 검체채수기록부에 기록한다. pH 측정기는 사용 전 보정(calibration) 한다.

바) 용수 배출구(수도꼭지 등)를 잠그고 검체가 다음의 조건에 해당되어 부가장치의 연결이 필요한지의 여부를 결정하여 연결한다.

(1) pH 8이상일 경우 멸균된 튜브로 단일주입기(ⓑ)와 1 M 염산 용액이 담긴 메스실린더를 연결하고, 배출구(수도꼭지 등)를 다시 열어 용수의 pH가 6.5～7.5가 되도록 단일 주입기를 통해 1 M 염산 용액을 흘려보낸다. 용수유출구(ⓚ)로 흘러나온 용수의 pH를 측정해 바이러스 검체 채수기록부에 기록한다.

(2) 잔류염소 제거를 위해 위와 같이 단일주입기를 연결하여 식품용수 3.8 L(1 gal) 당 2% 티오황산나트륨 용액 10 mL이 주입되도록 한다.

* (1)과 (2)번이 모두 해당할 경우 이중주입기를 연결하여 사용한다.

사) 바이러스검체 채수기록부에 검체 채취일, 시작 시간, 유량계의 초기 수치를 기록한다.

아) 알루미늄박을 제거한 양전하 카트리지 필터를 탈리액 주입구(ⓔ)와 유출구(ⓘ) 사이에 연결한다.

자) 용수를 천천히 흐르게 하면서 카트리지 하우징 상단의 감압단추(ⓕ, vent button)를 눌러 내부공기가 완전히 빠지도록 한 후, 수도꼭지를 완전히 열어 준다.

차) 압력게이지가 200 kPa(30 PSI) 이하로 유지되도록 유량조절 밸브를 조정하고 식품용수 1,500～1,800 L를 통과시킨 후, 용수 배출구(수도꼭지 등)를 잠근다.

카) 바이러스 검체 채수기록부에 검체채취 종료일, 종료 시간, 유량계의 최종 수치 등을 기록한다.

타) 표준필터장치로부터 카트리지 하우징(ⓗ)을 분리하고 양전하 카트리지 필터를 거꾸로 하여 남은 물을 버린 후 하우징 양끝의 연결된 개구부를 멸균된 알루미늄박으로 싼다.

파) 양전하 카트리지 필터를 아이스박스에 담고 얼음팩 등을 사용하여 냉장상태(냉동시켜서는 아니 된다)로 유지하여 즉시 실험실로 운반한다.

2) 바이러스 탈리과정

가) 냉장 보관하여 운반한 필터는 채수 시작 시간부터 24시간 내에 실험실에서 바이러스 탈리 시험을 실시하여야 한다. 다만, 부득이한 경우로 인해 24시간 내에 탈리시험이 불가할 경우 최대 72시간이 넘지 않도록 한다.

나) 탈리용 거치대에 카트리지 하우징을 장착한 후 유량조절 밸브를 모두 닫는다.

다) 탈리액 주입구에 연동정량펌프 호스를 연결한 후 연동정량펌프와 1.5% Beef extract 용액이 채워져 있는 유리병에 호스를 차례로 연결하되, 1-MDS 필터는 1 L, NanoCeram 필터에는 0.5 L의 1.5% Beef extract 용액을 사용한다.

라) 탈리액 유출구에 유출용 호스를 연결하여 1.5% Beef extract 용액이 들어 있는 유리병에 넣고 탈리액 유출구를 닫는다.

마) 연동정량펌프를 가동하여 양전하 카트리지 필터 하우징 안으로 1.5% Beef extract 용액이 양전하 카트리지 필터 내에 완전히 차도록 한 후 감압단추를 통해 1.5% Beef extract 용액이 넘쳐 흘러나오기 시작하면 감압단추에서 손을 떼고, 연동정량펌프 가동을 멈춘 후 5분간 정치한다.

※ 감압단추는 탈리액이 양전하 카트리지 필터 안으로 가득 채워질 때까지 눌러준다.

바) 탈리액 유출구를 열고 연동정량펌프를 다시 가동한 후 하우징에 채워져 있는 1.5% Beef extract 용액이 서서히 필터를 통과하도록 한다. 통과한 완충액은 1.5% Beef extract 용액이 들어있던 유리병에 수집한다. 탈리액을 회수할 때는 거품이 없도록 주의하여야 한다.

※ 연동정량펌프 대신 양압펌프와 압력통을 사용하여 탈리과정을 진행할 수도 있다.

사) 유리병에 수집된 탈리액은 라)～바)의 과정을 2회 반복한다.

아) 최종 탈리액은 1 M 염산 용액으로 pH를 7.0～7.5 사이로 조절하고 멸균된 메스실린더를 사용하여 부피를 기록한다.

자) 탈리액은 24시간 이내에 농축시험이 가능할 경우 4℃에서 보관하며, 농축 시험을 즉시 시행하기 어려울 때에는 -70℃에서 보관한다.

3) 바이러스 농축과정

가) 최종 탈리액을 교반기에서 혼합하면서 1 M 염산용액으로 pH를 3.5±0.1로 조절한 후, 실온에서 30분간 천천히 섞는다.

나) 침전물이 생기면 탈리액을 멸균한 원심분리용기에 옮겨 원심분리한다(2,500 G 15분, 4℃).

다) 원심분리 후, 상등액을 제거하고 남은 침전물에 0.15 M sodium phosphate 완충액(pH 9.0～9.5)을 20～30 mL 넣어 완전히 부유 시킨 후 실온에 10분간 방치한다.

라) 부유시킨 용액을 원심분리한다(7,000 G, 10분, 4℃).

마) 상등액을 취해 1 M 염산용액으로 pH 7.0～7.5로 조절한다.

바) 미생물오염을 방지하기 위해 30 mL 주사기를 이용하여 상등액을 0.22 μm 주사기 필터로 여과한다. 검체 중의 바이러스가 필터에 흡착되는 것을 방지하기 위하여 사전에 0.22 μm 주사기 필터에 10～20 mL의 1.5% Beef extract 용액(pH 7.0～7.5)을 통과시킨다.

사) 최종 농축 검체량(FCSV=final concentrated sample volume)을 기록하고 검체를 24시간 이내에 분석할 경우는 4℃에 보관하고 나머지는 분석 전까지 -70℃에 보관한다.

아) 최종 농축검체 20～30 mL는 바이러스 유전자 추출을 위한 검체로 사용한다.

4) 바이러스 유전자 추출 과정

시판되는 바이러스 RNA 추출 키트(kit)를 사용하며, 제조사가 제시하는 적절한 실험법에 따라 실시한다.

※ 재현성 및 검출효율 등을 고려하여 QIAGEN-Viral RNA Mini Kits 또는 동등 이상의 제품이 사용이 가능하며, 또한 자동유전자 추출장치를 사용할 경우에도 바이러스 RNA 추출 키트를 사용하여 바이러스 유전자를 추출할 수 있다.

가) 바이러스 유전자 추출 시 검체와 동일한 과정으로 음성대조군(negative control)을 사용하여 유전자를 추출하며 검체의 경우 시험 진행 중 오염 여부를 확인하기 위해 2개의 RNA를 추출한다.

나) 검체 농축액과 음성대조군 각 280 μL에 AVL 완충액(guanidine thiocyanate 함유) 1,120 μL를 각각 혼합하여 실온에서 10분 동안 방치한 후 가볍게 원심분리기를 이용하여 원심분리(spin-down)한다.

다) 여기에 95～100% 에탄올 1,120 μL을 넣어 혼합한 후 가볍게 원심분리(spin-down)한다.

라) 혼합액 630 μL을 소량 원심(Mini spin) 컬럼으로 옮겨 6,000 G에서 1분간 원심분리하고 컬럼을 새로운 회수용(collection) 튜브로 옮긴 다음 남은 혼합액을 630 μL씩 동일한 방법으로 컬럼에 첨가하여 원심분리한다.

마) 소량 원심(Mini spin) 컬럼을 새로운 회수용(collection) 튜브로 옮겨 AW1 완충액(guanidine hydrochloride 함유) 500 μL을 넣고 6,000 G로 1분간 원심분리 후 컬럼을 새로운 회수용(collection) 튜브로 옮긴다.

바) AW2 완충액 500 μL을 넣고 20,000 G로 3분간 원심분리한 후 컬럼을 새로운 1.5 mL 회수용(collection) 튜브로 옮긴다.

사) AVE 완충액(sodium azide 함유) 60 μL를 넣고 6,000 G로 1분간 원심분리하여 다음의 RT-PCR(Reverse transcription-Polymerase chain reaction)을 수행하기 위한 주형(template)으로 사용한다.

5) 사포바이러스 유전자 PCR 과정 및 결과판정

RT-PCR(Reverse transcription-PCR)과정에서는 사포바이러스를 인위적으로 조합하여 합성한 RNA 등을 PCR 양성대조군으로 사용할 수 있다.

가) One-step RT-PCR(Reverse transcription -PCR) 방법은 아래와 같이 수행한다.

(1) One-step RT-PCR(Reverse transcription -PCR) 조성조건은 표 1과 같이  Mastermix(2X) 9.5 μL, Reverse transcriptase (50unit/μL) 0.5 μL, 프라이머(SV-F11, SV-R1)는 각 2 μL, 추출 RNA 5 μL를 첨가하여 증류수로 총 25 μL로 맞추고 반응시킨다

(2) One-step RT-PCR(Reverse transcription -PCR) 반응조건은 표 2와 같이 45℃에서 30분, 94℃에서 5분 변성시키고, 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분 30초를 1회로 하여 35회 반응시킨 후, 72℃에서 7분간 연장 반응시킨다. 상기 반응 종료 후 PCR 생성물에 대하여 Nested PCR을 실시한다.

표 1. 사포바이러스 One-step RT-PCR(Reverse transcription -PCR) 반응액 조성

Component	Volume	Primers
Mastermix(2X)	9.5 μL	-
Reverse transcriptase(50unit/μL)	0.5 μL	-
D.W.	6μL	-
Forward primer(20pmol)	2 μL	SV-F11
Reverse primer(20pmol)	2 μL	SV-R1
Extracted RNA, PCR control	5 μL	-
Total	25μL	-

표 2. 사포바이러스 One-step RT-PCR(Reverse transcription -PCR) 반응조건 및 온도

	온도	시간	Cycle
cDNA 합성(cDNA synthesis) 초기 변성(predenaturation)	45℃ 94℃	30 min 5 min	1 cycle
변성(denaturation) 결합(annealing) 확장(extension)	94℃ 55℃ 72℃	30 sec 30 sec 1 min 30 sec	35 cycles
최종신장(post-elongation)	72℃	7 min	1 cycle
보관	4℃	∞	∞

나) Nested PCR 방법은 아래와 같이 수행한다.

(1) One-step RT-PCR(Reverse transcription -PCR) 산물을 주형으로 하여 표 3과 같이 Nested PCR을 실시한다. 1차 PCR산물 2 μL, 10x 완충액(MgCl2 포함) 5 μL, dNTPs(10 mM) 4 μL, Taq DNA polymerase(5 unit/μL) 1 μL, 프라이머(SV-F21, SV-R2)는 각 2.5 μL 첨가한 다음 최종 증류수로 총 50 μL로 맞춘 후 Nested PCR을 실시한다.

(2) PCR 반응조건은 표 4와 같이 94℃에서 5분간 DNA를 변성시키고 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분 30초를 1회로 하여 25회를 반응시킨 후 72℃에서 7분간 연장 반응시킨다.

표 3. 사포바이러스 Nested PCR 반응액 조성

Component	Volume	Primers
dNTPs(10mM)	4 μL	-
10x Buffer(with MgCl2)	5 μL	-
D.W.	33 μL	-
Forward primer(20 pmol)	2.5 μL	SV-F21
Reverse primer(20 pmol)	2.5 μL	SV-R2
Taq DNA polymerase(5 unit/μL)	1 μL	-
1st PCR Product	2 μL	-
Total	50 μL

표 4. 사포바이러스 Nested PCR 반응조건 및 온도

	온도	시간	cycle
초기 변성 (predenaturation)	94℃	5 min	1 cycle
변성(denaturation) 결합(annealing) 확장(extension)	94℃ 55℃ 72℃	30 sec 30 sec 1 min 30 sec	30 cycles
최종신장(post-elongation)	72℃	7 min	1 cycle
보관	4℃	∞	∞

(3) PCR 반응 종료 후 PCR 증폭 반응액 5 μL를 전기영동 완충액(gel loading buffer) 1 μL와 혼합한 다음 젤(gel)의 각 홈에 검체를 조심스럽게 넣고 나머지 한 홈에 PCR 증폭산물의 크기를 식별하기에 적당한 표식 DNA(marker DNA) 7 μL를 넣는다. 1.5% 아가로스 젤(agarose gel) 상에서 100V로 전기영동한 후 Ethidium Bromide(EtBr) 염색액(10 mg/mL)으로 30분간 염색한 후 증류수로 10분간 탈색하고 자외선 조사기(UV transilluminator)로 조사하여 증폭된 DNA 밴드를 관찰한다.

(4) 사포바이러스 유전자 증폭에 사용하는 프라이머는 표 5와 같다.

표 5. 사포바이러스 PCR 프라이머 염기서열

Primer	Sequence(5'→3')	Application	PCR Size(bp)
SV-F11	GCY TGG TTY ATA GGT GGT AC	One-step RT-PCR	781
SV-R1	CWG GTG AMA CMC CAT TKT CCA T	One-step RT-PCR/
SV-F21	ANT AGT GTT TGA RAT GGA GGG	Nested PCR/ Sequencing	415
SV-R2	GWG GGR TCA ACM CCW GGT GG	Nested PCR/ Sequencing

다) 1차 결과 확인

(1) 아가로즈 젤(agarose gel)상에서 시료에 PCR 증폭산물이 415 bp의 밴드가 있을 경우 사포바이러스로 일차 확인한다.

(2) 만일 음성대조군(negative control)에서 PCR 밴드가 확인 될 경우 등은 재시험을 실시해야한다(표 6 참고).

(3) 사포바이러스가 일차 확인된 경우 최종 확인을 위하여 아가로스 젤(agarose gel)상에서 해당부위를 절취하여 PCR 산물을 정제한 후 염기서열(DNA sequencing)을 분석하여 최종 판정한다.

표 6. 사포바이러스 PCR 결과판정(예시)

	추출 RNA(시료)	음성대조군	1차 판정
1	+	-	PCR 검출
	+
2	+	-	PCR 검출
	-
3	+	+	재 실험
	+
4	-	-	PCR 불검출
	-

+ : 사포바이러스 PCR 밴드 확인됨, - : 밴드가 확인되지 않음

라) 최종 검출 판정

(1) 염기서열 분석(DNA sequencing)을 위하여 다)의 (3)에서 정제된 DNA 1 μL를 주형으로  SV-F21과 SV-R2 프라이머를 사용한다.

(2) 염기서열 분석(sequencing) 반응을 위한 혼합 조건은 각 유전자형 Nested 프라이머(primer, 1 pmol)를 독립된 각각의 튜브에 2 μL, dye-terminator 2 μL, 정제 DNA 2 μL를 첨가하여 증류수로 최종 10 μL가 되도록 하고 96℃에서 1분간 DNA를 변성시킨 후, 96℃에서 10초간, 50℃에서 5초간, 60℃에서 4분간을 1회로 하여 25회 반응시킨 다음 60℃에서 10분간 연장반응을 시킨다.

(3) PCR 산물은 염기서열 분석(DNA sequencing)하되 2종 이상의 유전자가 혼합되어 있는 경우에는 클로닝 염기서열 분석(Cloning DNA sequencing)을 재실시 한다. 염기서열 분석(DNA sequencing)에 의해 결정된 염기서열은 사포바이러스 유전자 데이터베이스(Referecne sequence 및 NCBI blast)와 비교하여 사포바이러스로 확인되었을 경우 검출된 것으로 최종 확인한다.

5. ～ 9. (현행과 같음)

10. 식품 중 유해물질

10.1 ～ 10.3 (현행과 같음)

10.4 발기부전치료제 및 그 유사물질

가. ～ 다. (현행과 같음)

라. 시약 및 시액

1) ～ 2) (현행과 같음)

3) 표준원액 : 호모실데나필(homosildenafil), 홍데나필(hongdenafil), 하이드록시호모실데나필(hydroxyhomosildenafil), 아미노타다라필(aminotadalafil), 슈도바데나필(pseudovardenafil), 하이드록시홍데나필(hydroxyhongdenafil), 디메틸실데나필(dimethylsildenafil), 잔소안트라필(xanthoanthrafil), 하이드록시바데나필(hydroxyvardenafil), 노르네오실데나필(norneosildenafil), 데메틸홍데나필(demethylhongdenafil), 피페리디노홍데나필(piperidinohongdenafil), 카보데나필(carbodenafil), 치오실데나필(thiosildenafil), 디메틸치오실데나필(dimethylthiosildenafil), 아세틸바데나필(acetylvardenafil), 벤질실데나필(benzylsildenafil), 노르네오바데나필(norneovardenafil), 옥소홍데나필(oxohongdenafil), 치오호모실데나필(thiohomosildenafil), 데설포바데나필(desulfovardenafil), 니트로데나필(nitrodenafil), 싸이클로펜티나필(cyclopenpentynafil), 옥틸노르타다라필(octylnortadalafil), 클로로데나필(chlorodenafil), 신나밀데나필(cinnamyldenafil), 치오퀴나피페리필(thioquinapiperifil), 하이드록시치오호모실데나필(hydroxythiohomosildenafil), 클로로프레타다라필(chloropretadalafil), 하이드록시클로로데나필(hydroxychlorodenafil), 디클로로데나필(dichlorodenafil), 데메칠타다라필(demethyltadalafil), 아세트아미노타다라필(acetaminotadalafil), 메틸하이드록시호모실데나필(methylhydroxyhomosildenafil), 프로폭시페닐치오호모실데나필(propoxyphenylthiosildenafil), 프로폭시페닐치오하이드록시호모실데나필(propoxyphenylthiohydroxyhomosildenafil), 프로폭시페닐치오실데나필(propoxyphenylthiosildenafil), 프로폭시페닐치오아일데나필(Propoxyphenylthioaildenafil), 호모타다라필(Homotadalafil), 아세틸산(acetyl acid), 겐데나필(gendenafil), 이미다조사가트리아지논(imidazosagatriazinone), cis-사이클로펜틸타다라필(cis-cyclopentyltadalafil), trans-사이클로펜틸타다라필(trans-cyclopentyltadalafil), 이소프로필노르타다라필(Isopropylnortadalafil), 데스카본실데나필(descarbonsildenafil), 실데나필(sildenafil), 타다라필(tadalafil), 바데나필(vardenafil), 유데나필(udenafil), 미로데나필(mirodenafil), 아바나필(avanafil) 각각의 표준품을 메탄올에 녹여 각각 1,000 mg/L이 되게 한다.

4) ∼ 6) (현행과 같음)

마. ∼ 아. (현행과 같음)

자. 확인시험

(현행과 같음)

1) 액체크로마토그래프/질량분석기의 측정조건

가) 칼럼 : C18 (2.0 mm × 100 mm, 3 μm) 또는 이와 동등한 것

나) (현행과 같음)

다) 이동상

(1) 이동상 A : 0.1% formic acid를 함유한 물

(2) (현행과 같음)

라) ∼ 사) (현행과 같음)

차. 발기부전치료제 유사물질의 분자량 및 화학구조식

① 호모실데나필(Homosildenafil) (C23H32N6O4S, 488.61)	② 홍데나필(Hongdenafil) (C25H34N6O3, 466.59)
③ 하이드록시호모실데나필 (Hydroxy homosildenafil) (C23H32N6O5S, 504.61)	④ 아미노타다라필(Amino tadalafil) (C21H18N4O4, 390.40)
⑤ 슈도바데나필(Pseudo-vardenafil) (C22H29N5O4S, 459.57)	⑥ 하이드록시홍데나필(Hydroxy hongdenafil) (C25H34N6O4, 482.59)
⑦ 디메칠실데나필(Dimethylsildenafil) (C23H32N6O4S, 488.61)	⑧ 잔소안트라필(Xanthoanthrafil) (C19H23N3O6, 389.41)
⑨ 하이드록시바데나필(Hydroxyvardenafil) (C23H32N6O5S, 504.61)	⑩ 노르네오실데나필(Norneosildenafil) (C22H29N5O4S, 459.57)
⑪ 데메틸홍데나필(Demethylhongdenafil) (C24H32N6O3, 452.55)	⑫ 피페리디노홍데나필(Piperidinohongdenafil) (C24H31N5O3, 437.55)
⑬ 카보데나필(Carbodenafil) (C24H32N6O3, 452.56)	⑭ 치오실데나필(Thiosildenfil) (C20H30N6O3S2, 490.64)
⑮ 디메틸치오실데나필 (Dimethylthiosildenafil) (C23H32N6O3S2, 504)	⑯ 아세틸바데나필(Acetylvardenafil) (C25H34N6O3, 466.59)
⑰ 벤질실데나필(Benzylsildenafil) (C28H34N6O4S, 550.68)	⑱ 노르네오바데나필(Norneovardenafil) (C18H20N4O4, 356.38)
⑲ 옥소홍데나필(Oxohongdenafil) (C25H32N6O4, 480.57)	치오호모실데나필(Thiohomosildenafil) (C23H32N6O3S2, 504.68)
데설포바데나필(Desulfovardenafil) (C17H20N4O2, 312.37)	니트로데나필(Nitrodenafil) (C17H19N5O4, 357.37)
싸이클로펜티나필(Cyclopentynafil) (C26H36N6O4S, 528.68)	옥틸노르타다라필(N-Octylnortadalafil) (C29H33N3O4, 487.60)
클로로데나필(Chlorodenafil) (C19H21ClN4O3, 388.86)	신나밀데나필(Cinnamyldenafil) (C32H38N6O3, 554)
치오퀴나피페리필(Thioquinapiperifil) (C24H28N6OS, 448.59)	하이드록시치오호모실데나필(Hydroxythiohomosildenafil) (C23H32N6O4S2, 520.68)
클로로프레타다라필(Chloropretadalafil) (C22H19ClN2O5, 426.86)	하이드록시클로로데나필(Hydroxychlorodenafil) (C19H23ClN4O3, 390.87)
디클로로데나필(Dichlorodenafil) (C19H21Cl2N4O2, 407.30)	데메칠타다라필(Demethyltadalafil) (C21H17N3O4, 375.38)
아세트아미노타다라필(Acetaminotadalafil) (C23H20N4O5, 432.43)	㉞메틸하이드록시호모실데나필(Methylhydroxyhomosildenafil) (C24H34N6O5S, 518.00)
㉟ 프로폭시페닐 치오호모실데나필 (Propoxyphenyl thiohomosildenafil) (C24H34N6O3S2, 518.70)	㊱ 프로폭시페닐 치오하이드록시호모실데나필 (Propoxyphenyl thiohydroxyhomosildenafil) (C24H34N6O4S2, 534.69)
㊲ 프로폭시페닐치오실데나필 (Propoxyphenylthiosildenafil) (C23H32N6O3S2, 504.67)	프로폭시페닐치오아일데나필 (Propoxyphenylthioaildenafil) (C24H34N6O3S2, 518.70)
호모타다라필(Homotadalafil) (C23H21N3O4, 403.43)	㊵ 아세틸산(Acetyl acid) (C18H20N4O4, 356.38)
㊶ 겐데나필(Gendenafil) (C19H22N4O3, 354.41)	㊷ 이미다조사가트리아지논(Imidazosagatriazinone) (C17H20N4O2, 312.37)
㊸ cis-사이클로펜틸타다라필(cis-Cyclopentyltadalafil) (C26H25N3O4, 443)	㊹ trans-사이클로펜틸타다라필(trans-Cyclopentyltadalafil) (C26H25N3O4, 443)
㊺ 데스카본실데나필(Descarbonsildenafil) (C21H30N6O4S, 462.57)	㊻ 이소프로필노르타다라필(Isopropylnortadalafil) (C24H23N3O4, 417.47)

10.5 ～ 10.6 (현행과 같음)

10.7 기타 의약품 성분

10.7.1 ∼ 10.7.2 (생  략)

<신    설>

<신    설>

<신    설>

<신     설>

10.8 ～ 10.13 (생  략)

11. ～ 13. (생  략)

10.7 기타 의약품 성분

10.7.1 ∼ 10.7.2 (현행과 같음)

10.7.3 페놀프탈레인(phenolphthalein)

가. 시험법의 적용범위

모든 식품에 적용한다.

나. 분석원리

균질화한 검체를 취하여 액-액 추출하고 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기(UV photometric detector), PDA 검출기로 분석한다.

다. 장치

1) 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기(LC/UV photometric detector), PDA 검출기(LC/PDA), 액체크로마토그래프/질량분석기(LC/MS)를 사용한다.

라. 시약 및 시액

1) 유기용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

2) 물 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액 : 페놀프탈레인(phenolphthalein) 표준품을 메탄올에 녹여 1,000 mg/L이 되게 한다.

4) 표준용액 : 표준원액을 메탄올에 녹여 1～100 mg/L의 범위가 되도록 적당한 농도로 희석한다.

5) sodium-1-hexane sulfonate : 이온쌍 크로마토그래피용

6) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액의 조제

균질화한 검체 1 g을 정확히 달아 50 mL 용량의 메스플라스크에 넣고 물 15 mL를 가하여 습윤화한다. 메스플라스크에 메탄올 25 mL를 가하여 10분간 초음파 추출한 후 메탄올로 눈금을 채우고 0.45 ㎛ 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 사용한다. 단, 시험용액의 농도가 검량곡선의 농도범위를 벗어날 경우 농도 범위내로 희석하여 사용한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프의 측정조건

가) 컬럼 : C18 (4.6 mm × 250 mm, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

나) 컬럼 온도 : 40℃

다) 이동상

(1) 이동상 A : 0.5 mM sodium-1-hexane sulfonate를 함유한 0.1% 인산 용액

(2) 이동상 B : 95% 아세토니트릴

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0	85	15
6	85	15
15	70	30
30	60	40
32	60	40
42	0	100
50	0	100
52	85	15
60	85	15

라) 이동상 유량 : 1.2 mL/min

마) UV 검출기파장 : 291 nm

바) PDA 검출기파장 : 200～400 nm

2) 검량선의 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

3) 표준품의 크로마토그램 및 스펙트럼

4) 정량한계 : 25 mg/kg

사. 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피크는 동일한 측정조건에서 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치하여야 하며 PDA 검출기에서 표준용액과 시험용액이 동일한 스펙트럼을 보여야 한다.

아. 정량시험

정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 시험결과를 피크 높이법 또는 피크 면적법에 따라 정량한다.

1) 계산방법

검량곡선에서 얻어진 표준물질의 피크 높이 또는 피크 면적을 Y축으로 하고 표준물질의 농도를 X축으로 하여 검량곡선을 작성하고 시험용액의 높이 또는 면적을 Y축에 대입하여 페놀프탈레인의 농도를 계산한다.

시료 중 함량(mg/g) = C ×	V	× D
	S

C : 검량곡선에서 계산된 페놀프탈레인의 농도 (mg/L)

V : 시험용액의 최종 부피 (L)

S : 검체 채취량 (g)

D : 희석배수

자. 확인시험

액체크로마토그래프/질량분석기로 분석하였을 때 시험용액 중 표준물질의 m/z 값은 표준용액 중 표준물질의 m/z 값과 일치하여야 한다.

1) 액체크로마토그래프/질량분석기의 측정조건

가) 컬럼 : C18 (2.0 mm × 100 mm, 3 ㎛) 또는 이와 동등한 것

나) 컬럼온도 : 40℃

다) 이동상

(1) 이동상 A : 0.1% formic acid를 함유한 물

(2) 이동상 B : 0.1% formic acid를 함유한 아세토니트릴

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0	95	5
3	95	5
18	20	80
18.1	0	100
20.9	0	100
21	95	5
25	95	5

라) 이동상 유량 : 0.3 mL/min

마) 이온화 방법 : ESI

바) capillary temperature : 340℃

사) spray voltage : 4.0 kV

아) MRM transition

물질	분자량	Ion mode	Precursor ion (m/z)	Fragment ion (m/z)
페놀프탈레인 (C20H14O4)	318.32	Positive	319	225, 197

10.7.4 요힘빈(yohimbine) 및 이카린(icariin)

가. 시험법의 적용범위

모든 식품에 적용한다.

나. 분석원리

균질화한 검체를 취하여 액-액 추출하고 액체크로마토그래프/ 자외부흡광검출기(UV photometric detector), PDA 검출기로 분석한다.

다. 장치

1) 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기(LC/UV photometric detector), PDA 검출기(LC/PDA), 액체크로마토그래프/질량분석기(LC/MS)를 사용한다.

라. 시약 및 시액

1) 유기용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

2) 물 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액 :  요힘빈(yohimbine) 및 이카린(icariin) 표준품을 메탄올에 녹여 각각 1,000 mg/L이 되게 한다.

4) 표준용액 : 표준원액을 각각 메탄올에 녹여 1～100 mg/L의 범위가 되도록 적당한 농도로 희석한다.

5) sodium-1-hexane sulfonate : ion pare 크로마토그래피용

6) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액의 조제

균질화한 검체 1 g을 정확히 달아 50 mL 용량의 메스플라스크에 넣고 물 15 mL를 가하여 습윤화한다. 메스플라스크에 메탄올 25 mL를 가하여 10분간 초음파 추출한 후 메탄올로 눈금을 채우고 0.45 ㎛ 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 사용한다. 단, 시험용액의 농도가 검량곡선의 농도범위를 벗어날 경우 농도 범위내로 희석하여 사용한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프의 측정조건

가) 컬럼 : C18 (4.6 mm × 250 mm, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

나) 컬럼온도 : 40℃

다) 이동상

(1) 이동상 A : 0.5 mM sodium-1-hexane sulfonate를 함유한 0.1% 인산 용액

(2) 이동상 B : 95% 아세토니트릴

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0	85	15
6	85	15
15	70	30
30	60	40
32	60	40
42	0	100
50	0	100
52	85	15
60	85	15

라) 이동상 유량 : 1.2 mL/min

마) UV 검출기파장 : 291 nm

바) PDA 검출기파장 : 200～400 nm

2) 검량선의 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

3) 표준품의 크로마토그램 및 스펙트럼

(a) 요힘빈 및 이카린의 크로마토그램

(b) 요힘빈의 스펙트럼

(c) 이카린의 스펙트럼

4) 정량한계 : 25 mg/kg

사. 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피크는 동일한 측정조건에서 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치하여야 하며 PDA 검출기에서 표준용액과 시험용액이 동일한 스펙트럼을 보여야 한다.

아. 정량시험

정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 시험결과를 피크 높이법 또는 피크 면적법에 따라 정량한다.

1) 계산방법

검량곡선에서 얻어진 표준물질의 피이크높이 또는 피이크면적을 Y축으로 하고 표준물질의 농도를 X축으로 하여 검량곡선을 작성하고 시험용액의 높이 또는 면적을 Y축에 대입하여 요힘빈 및 이카린의 농도를 계산한다.

시료 중 함량(mg/g) = C ×	V	× D
	S

C : 검량곡선에서 계산된 요힘빈, 이카린 각각의 농도 (mg/L)

V : 시험용액의 최종 부피 (L)

S : 검체 채취량 (g)

D : 희석배수

자. 확인시험

액체크로마토그래피-질량분석기로 분석하였을 때 시험용액 중 표준물질의 m/z 값은 표준용액 중 표준물질의 m/z 값과 일치하여야 한다.

1) 액체크로마토그래프/질량분석기의 측정조건

가) 컬럼 : C18 (2.0 mm × 100 mm, 3 ㎛) 또는 이와 동등한 것

나) 컬럼온도 : 40℃

다) 이동상

(1) 이동상 A : 0.1% formic acid를 함유한 물

(2) 이동상 B : 0.1% formic acid를 함유한 아세토니트릴

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0	95	5
3	95	5
18	20	80
18.1	0	100
20.9	0	100
21	95	5
25	95	5

라) 이동상 유량 : 0.3 mL/min

마) 이온화 방법 : ESI

바) capillary temperature : 340℃

사) spray voltage : 4.0 kV

아) MRM transition

물질	분자량	Ion mode	Precursor ion (m/z)	Fragment ion (m/z)
요힘빈(C21H26N2O3)	354.4	Positive	355	144, 212
이카린(C9H13N)	676.7	Negative	677	367, 513

10.7.5 카스카로사이드(Cascaroside A, B, C, D)

가. 시험법의 적용범위

모든 식품에 적용한다.

나. 분석원리

균질화한 검체를 취하여 액-액 추출하고 액체크로마토그래프/ 자외부흡광검출기(UV photometric detector), PDA 검출기로 분석한다.

다. 장치

1) 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기(LC/UV photometric detector), PDA 검출기(LC/PDA), 액체크로마토그래프/질량분석기(LC/MS)를 사용한다.

라. 시약 및 시액

1) 유기용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

2) 물 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액 : 카스카로사이드 A(cascaroside A), 카스카로사이드 B(cascaroside B), 카스카로사이드 C(cascaroside C), 카스카로사이드 D(cascaroside D) 표준품을 각각 메탄올에 녹여 1,000 mg/L이 되게 한다.

4) 표준용액 : 표준원액을 메탄올에 녹여 1～100 mg/L의 범위가 되도록 적당한 농도로 희석한다.

5) sodium-1-hexane sulfonate : 이온쌍 크로마토그래피용

6) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액의 조제

균질화한 검체 1 g을 정확히 달아 50 mL 용량의 메스플라스크에 넣고 물 15 mL를 가하여 습윤화한다. 메스플라스크에 메탄올 25 mL를 가하여 10분간 초음파 추출한 후 메탄올로 눈금을 채우고 0.45 ㎛ 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 사용한다. 단, 시험용액의 농도가 검량곡선의 농도범위를 벗어날 경우 농도 범위내로 희석하여 사용한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프의 측정조건

가) 컬럼 : C18 (4.6 mm × 250 mm, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

나) 컬럼온도 : 40℃

다) 이동상

(1) 이동상 A : 0.5 mM sodium-1-hexane sulfonate를 함유한 0.1% 인산 용액

(2) 이동상 B : 95% 아세토니트릴

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0	85	15
6	85	15
15	70	30
30	60	40
32	60	40
42	0	100
50	0	100
52	85	15
60	85	15

라) 이동상 유량 : 1.2 mL/min

마) UV 검출기파장 : 291 nm

바) PDA 검출기파장 : 200～400 nm

2) 검량선의 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

3) 표준품의 크로마토그램 및 스펙트럼

(a) 카스카로사이드 A, B, C, D의 크로마토그램

(b) 카스카로사이드 A, B의 스펙트럼

(C) 카스카로사이드 C, D의 스펙트럼

4) 정량한계 : 25 mg/kg

사. 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피크는 동일한 측정조건에서 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치하여야 하며 PDA 검출기에서 표준용액과 시험용액이 동일한 스펙트럼을 보여야 한다.

아. 정량시험

정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 시험결과를 피크 높이법 또는 피크 면적법에 따라 정량한다.

1) 계산방법

검량곡선에서 얻어진 표준물질의 피크 높이 또는 피크 면적을 Y축으로 하고 표준물질의 농도를 X축으로 하여 검량곡선을 작성하고 시험용액의 높이 또는 면적을 Y축에 대입하여 카스카로사이드의 농도를 계산한다.

시료 중 함량(mg/g) = C ×	V	× D
	S

C : 검량곡선에서 계산된 카스카로사이드의 농도 (mg/L)

V : 시험용액의 최종 부피 (L)

S : 검체 채취량 (g)

D : 희석배수

자. 확인시험

액체크로마토그래프/질량분석기로 분석하였을 때 시험용액 중 표준물질의 m/z 값은 표준용액 중 표준물질의 m/z 값과 일치하여야 한다.

1) 액체크로마토그래프/질량분석기의 측정조건

가) 컬럼 : C18 (2.0 mm × 100 mm, 3 ㎛) 또는 이와 동등한 것

나) 컬럼온도 : 40℃

다) 이동상

(1) 이동상 A : 0.1% formic acid를 함유한 물

(2) 이동상 B : 0.1% formic acid를 함유한 아세토니트릴

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0	95	5
3	95	5
18	20	80
18.1	0	100
20.9	0	100
21	95	5
25	95	5

라) 이동상 유량 : 0.3 mL/min

마) 이온화 방법 : ESI

바) capillary temperature : 340℃

사) spray voltage : 4.0 kV

아) MRM transition

물질	분자량	Ion mode	Precursor ion (m/z)	Fragment ion (m/z)
카스카로사이드 A (C27H32O14)	580.1	Negative	579	297, 459
카스카로사이드 B (C27H32O14)	580.1	Negative	579	297, 459
카스카로사이드 C (C27H32O13)	563.8	Negative	563	281, 443
카스카로사이드 D (C27H32O13)	563.8	Negative	563	281, 443

10.7.6 센노사이드(sennoside A, B)

가. 시험법의 적용범위

모든 식품에 적용한다.

나. 분석원리

균질화한 검체를 취하여 액-액 추출하고 액체크로마토그래프/ 자외부흡광검출기(UV photometric detector), PDA 검출기로 분석한다.

다. 장치

1) 액체크로마토그래프/자외부흡광검출기(LC/UV photometric detector), PDA 검출기(LC/PDA), 액체크로마토그래프/질량분석기(LC/MS)를 사용한다.

라. 시약 및 시액

1) 유기용매 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

2) 물 : 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액 : 센노사이드 A(sennodise A), 센노사이드 B(sennodise B) 각각의 표준품을 아세토나이트릴/물 혼합액 (80/20, v/v)에 녹여 각각 1,000 mg/L이 되게 한다.

4) 표준용액 : 표준원액을 각각 메탄올에 녹여 1～100 mg/L이 되도록 적당한 농도로 희석한다.

5) sodium-1-hexane sulfonate : 이온쌍 크로마토그래피용

6) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액의 조제

균질화한 검체 1 g을 정확히 달아 50 mL 용량의 메스플라스크에 넣고 물 15 mL를 가하여 습윤화한다. 메스플라스크에 메탄올 25 mL를 가하여 10분간 초음파 추출한 후 메탄올로 눈금을 채우고 0.45 ㎛ 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 사용한다. 단, 시험용액의 농도가 검량곡선의 농도범위를 벗어날 경우 농도 범위내로 희석하여 사용한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프의 측정조건

가) 컬럼 : C18 (4.6 mm × 250 mm, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

나) 컬럼온도 : 40℃

다) 이동상

(1) 이동상 A : 0.5 mM sodium-1-hexane sulfonate를 함유한 0.1% 인산 용액

(2) 이동상 B : 95% 아세토니트릴

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0	85	15
6	85	15
15	70	30
30	60	40
32	60	40
42	0	100
50	0	100
52	85	15
60	85	15

라) 이동상 유량 : 1.2 mL/min

마) UV 검출기파장 : 220 nm

바) PDA 검출기파장 : 200～400 nm

2) 검량선의 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

3) 표준품의 크로마토그램 및 스펙트럼

(a) 센노사이드 A, B의 크로마토그램

(b) 센노사이드 A의 스펙트럼

(b) 센노사이드 B의 스펙트럼

4) 정량한계 : 25 mg/kg

사. 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피크는 동일한 측정조건에서 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치하여야 하며 PDA 검출기에서 표준용액과 시험용액이 동일한 스펙트럼을 보여야 한다.

아. 정량시험

정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 시험결과를 피크 높이법 또는 피크 면적법에 따라 정량한다.

1) 계산방법

검량곡선에서 얻어진 표준물질의 피크 높이 또는 피크 면적을 Y축으로 하고 표준물질의 농도를 X축으로 하여 검량곡선을 작성하고 시험용액의 높이 또는 면적을 Y축에 대입하여 센노사이드 A 및 B의 농도를 계산한다.

시료 중 함량(mg/g) = C ×	V	× D
	S

C : 검량곡선에서 계산된 센노사이드 A 및 B의 농도 (mg/L)

V : 시험용액의 최종 부피 (L)

S : 검체 채취량 (g)

D : 희석배수

자. 확인시험

액체크로마토그래프/질량분석기로 분석하였을 때 시험용액 중 표준물질의 m/z 값은 표준용액 중 표준물질의 m/z 값과 일치하여야 한다.

1) 액체크로마토그래프/질량분석기의 측정조건

가) 컬럼 : C18 (2.0 mm × 100 mm, 3 ㎛) 또는 이와 동등한 것

나) 컬럼온도 : 40℃

다) 이동상

(1) 이동상 A : 0.1% formic acid를 함유한 물

(2) 이동상 B : 0.1% formic acid를 함유한 아세토니트릴

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0	95	5
3	95	5
18	20	80
18.1	0	100
20.9	0	100
21	95	5
25	95	5

라) 이동상 유량 : 0.3 mL/min

마) 이온화 방법 : ESI

바) capillary temperature : 340℃

사) spray voltage : 4.0 kV

아) MRM transition

물질	분자량	Ion mode	Precursor ion (m/z)	Fragment ion (m/z)
센노사이드 A (C42H38O20)	862.7	Negative	861	224, 386, 699
센노사이드 B (C42H38O20)	862.7	Negative	861	224, 386, 699

10.8 ～ 10.13 (현행과 같음)

11. ～ 13. (현행과 같음)

[별표 1] “식품에 사용할 수 있는 원료”의 목록

1. (생   략)

2. 동물성

	품목명	이명 또는 영명	학명 또는 특성	사용 부위
1 ∼ 376	(생 략)
377	미흑점상어	Silky shark	Carcharhinus falciformis	-
378 ∼ 491	(생 략)
492	비악상어	Porbeagle, Beaumaris shark, Porbeagle	Lamna nasus	-
493 ∼ 660	(생 략)
661	장완흉상어	Oceanic whitetip shark	Carcharhinus longimanus	-
662 ∼ 952	(생 략)
(생 략)

3. ～ 4. (생   략)

[별표 2] (생  략)

[별표 1] “식품에 사용할 수 있는 원료”의 목록

1. (현행과 같음)

2. 동물성

	품목명	이명 또는 영명	학명 또는 특성	사용 부위
1 ∼ 376	(현행과 같음)
<삭 제>
377 ∼ 490	(현행 378∼491과 같음)
<삭 제>
491 ∼ 658	(현행 493∼660과 같음)
<삭 제>
659 ∼ 949	(현행 662∼952와 같음)
(현행과 같음)

3. ～ 4. (현행과 같음)

[별표 2] (현행과 같음)

[별표 3] 농산물의 농약 잔류허용기준

(1) 이미녹타딘(Iminoctadine)

(생   략)

마늘	0.5

파	1.0

기타농산물	0.05

(2) ∼ (4) (생   략)

(5) 노르플루라존(Norflurazon)

(생   략)

기타농산물	0.05

(6) ∼ (8) (생   략)

(9) 델타메트린(Deltamethrin)

(생   략)

기타농산물	0.01

(10) (생   략)

(11) 멥틸디노캅(Meptyldinocap)

(생   략)

감	0.5

오이	1.0

기타농산물	0.05

(12) 디디티(DDT)

(생   략)

기타농산물	0.05

(13) ∼ (14) (생   략)

(15) 디설포톤(Disulfoton)

(생   략)

기타농산물	0.02

(16) ∼ (17) (생   략)

(18) 디캄바(Dicamba)

(생   략)

수수	3.0

(19) ∼ (20) (생   략)

(21) 디클로르보스(Dichlorvos)

(생   략)

사과	2.0

오이	1.0

파	0.5

기타농산물	0.05

(22) ∼ (25) (생   략)

(26) 디페노코나졸(Difenoconazole)

(생   략)

기타농산물	0.05

(27) (생   략)

(28) 디펜아미드(Diphenamid)

(생   략)

기타농산물	0.05

(29) 디플루벤주론(Diflubenzuron)

(생   략)

기타농산물	0.05

(30) ∼ (36) (생   략)

(37) 메카밤(Mecarbam)

(생   략)

기타농산물	0.05

(38) ∼ (45) (생   략)

(46) 메틸브로마이드(Methylbromide)

(생   략)

기타농산물	20

(47) (생   략)

(48) 바미도티온(Vamidothion)

(생   략)

기타농산물	0.05

(49) (생   략)

(50) 베나락실(Benalaxyl)

(생   략)

기타농산물	0.05

(51) (생   략)

(52) 벤디오카브(Bendiocarb)

(생   략)

기타농산물	0.02

(53) ∼ (54) (생   략)

(55) 뷰프로페진(Buprofezin)

(생   략)

기타농산물	0.05

(56) ∼ (57) (생   략)

(58) 비에치시(BHC)

(생   략)

기타농산물	0.01

(59) ∼ (60) (생   략)

(61) 비펜트린(Bifenthrin)

(생   략)

기타농산물	0.05

(62) (생   략)

(63) 세톡시딤(Sethoxydim)

(생   략)

아몬드	1.0

피칸	1.0

견과류	1.0

면실	5.0

아보카도	1.0

해바라기씨	7.0

(64) (생   략)

(65) 사이로마진(Cyromazine)

(생   략)

느타리버섯	5.0

수박	0.3

기타농산물	0.05

(66) ∼ (67) (생   략)

(68) 사이할로트린(Cyhalothrin)

(생   략)

복숭아	0.5

(69) ∼ (70) (생   략)

(71) 아미트라즈(Amitraz)

(생   략)

기타농산물	0.05

(72) ∼ (75) (생   략)

(76) 알드린 및 디엘드린(Aldrin & Dieldrin)

(생   략)

기타농산물	0.01

(77) 알디카브(Aldicarb)

(생   략)

기타농산물	0.02

(78) ∼ (82) (생   략)

(83) 에티온(Ethion)

(생   략)

기타농산물	0.01

(84) (생   략)

(85) 에토펜프록스(Etofenprox)

(생   략)

기타농산물	0.01

(86) ∼ (87) (생   략)

(88) 에트림포스(Etrimfos)

(생   략)

기타농산물	0.01

(89) (생   략)

(90) 엔도설판(Endosulfan)

(생   략)

기타농산물	0.05

(91) 엔드린(Endrin)

(생   략)

기타농산물	0.01

(92) ∼ (100) (생   략)

(101) 이미다클로프리드(Imidacloprid)

(생   략)

기타농산물	0.05

(102) ∼ (105) (생   략)

(106) 이피엔(EPN)

(생   략)

기타농산물	0.05

(107) 키노메티오네이트

(Chinomethionat)

(생   략)

기타농산물	0.05

(108) 티오메톤(Thiometon)

(생   략)

기타농산물	0.05

(109) (생   략)

(110) 카두사포스(Cadusafos)

(생   략)

기타농산물	0.01

(111) (생   략)

(112) 카벤다짐(Carbendazim)

(생   략)

기타농산물	0.01

(113) 카보페노티온(Carbophenothion)

(생   략)

기타농산물	0.02

(114) 카보퓨란(Carbofuran)

(생   략)

바나나	0.1

(115) (생   략)

(116) 카탑(Cartap)

(생   략)

기타농산물	0.05

(117) 캡타폴(Captafol)

(생   략)

기타농산물	0.02

(118) ∼ (119) (생   략)

(120) 퀸토젠(Quintozene)

(생   략)

기타농산물	0.01

(121) ∼ (123) (생   략)

(124) 클로로벤질레이트(Chlorobenzilate)

(생   략)

기타농산물	0.02

(125) 클로로탈로닐(Chlorothalonil)

(생   략)

기타농산물	0.05

(126) ∼ (128) (생   략)

(129) 클로르펜빈포스(Chlorfenvinphos)

(생   략)

기타농산물	0.05

(130) 클로르프로팜(Chlorpropham)

(생   략)

감자	50.0

(131) (생   략)

(132) 클로르피리포스-메틸(Chlorpyrifos -methyl)

(생   략)

기타농산물	0.05

(133) (생   략)

(134) 터부트린(Terbutryn)

(생   략)

기타농산물	0.05

(135) 터부포스(Terbufos)

(생   략)

기타농산물	0.01

(136) ∼ (148) (생   략)

(149) 트리플루미졸(Triflumizole)

(생   략)

기타농산물	0.05

(150) ∼ (163) (생   략)

(164) 펜발러레이트(Fenvalerate)

(생   략)

아몬드	0.2

호두	0.2

<신    설>

(165) ∼ (172) (생   략)

(173) 포레이트(Phorate)

(생   략)

감자	0.2

마늘	0.1

(174) ∼ (175) (생   략)

(176) 포스멧(Phosmet, PMP)

(생   략)

기타농산물	0.05

(177) ∼ (179) (생   략)

(180) 플루실라졸(Flusilazole)

(생   략)

기타농산물	0.05

(181) 플루발리네이트(Fluvalinate)

(생   략)

기타농산물	0.01

(182) 플루시트리네이트(Flucythrinate)

(생   략)

기타농산물	0.05

(183) (생   략)

(184) 프로메트린(Prometryn)

(생   략)

기타농산물	0.05

(185) 프로사이미돈(Procymidone)

(생   략)

기타농산물	0.05

(186) 프로클로라즈(Prochloraz)

(생   략)

기타농산물	0.05

(187) (생   략)

(188) 프로파모카브(Propamocarb)

(생   략)

기타농산물	0.05

(189) ∼ (190) (생   략)

(191) 프로폭서(Propoxur)

(생   략)

기타농산물	0.05

(192) 프로피코나졸(Propiconazole)

(생   략)

옥수수	1.0

(193) ∼ (197) (생   략)

(198) 피페로닐부톡사이드(Piperonyl butoxide)

(생   략)

기타농산물	0.05

(199) ∼ (201) (생   략)

(202) 헵타클로르(Heptachlor)

(생   략)

기타농산물	0.01

(203) ∼ (206) (생   략)

(207) 테부페노자이드(Tebufenozide)

(생   략)

기타농산물	0.05

(208) ∼ (219) (생   략)

(220) 디에토펜카브(Diethofencarb)

(생   략)

기타농산물	0.05

(221) (생   략)

(222) 메파니피림(Mepanipyrim)

(생   략)

기타농산물	0.05

(223) ∼ (227) (생   략)

(228) 아족시스트로빈(Azoxystrobin)

(생   략)

기타농산물	0.05

(229) 카프로파마이드(Carpropamide)

(생   략)

기타농산물	0.05

(230) ∼ (231) (생   략)

(232) 트리사이클라졸(Tricyclazole)

(생   략)

기타농산물	0.05

(233) 펜사이큐론(Pencycuron)

(생   략)

기타농산물	0.1

(234) 펜피록시메이트(Fenpyroximate)

(생   략)

기타농산물	0.05

(235) ∼ (237) (생   략)

(238) 플루디옥소닐(Fludioxonil)

(생   략)

기타농산물	0.05

(239) ∼ (258) (생   략)

(259) 피리메타닐(Pyrimethanil)

(생   략)

기타농산물	0.05

(260) ∼ (290) (생   략)

(291) 족사마이드(Zoxamide)

(생   략)

기타농산물	0.05

(292) ∼ (293) (생   략)

(294) 터부틸라진(Terbuthylazine)

(생   략)

기타농산물	0.05

(295) ∼ (308) (생   략)

(309) 플루톨라닐(Flutolanil)

(생   략)

기타농산물	0.05

(310) ∼ (324) (생   략)

(325) 사이아조파미드(Cyazofamid)

(생   략)

기타농산물	0.05

(326) (생   략)

(327) 오리사스트로빈(Orysastrobin)

(생   략)

기타농산물	0.07

(328) ∼ (361) (생   략)

(362) 트리아자메이트(Triazamate)

(생   략)

기타농산물	0.05

(363) ∼ (369) (생   략)

(370) 벤티아발리카브아이소프로필

(Benthiavalicarb-isopropyl)

(생   략)

기타농산물	0.07

(371) 디니코나졸(Diniconazole)

(생   략)

기타농산물	0.05

(372) (생   략)

(373) 스피로메시펜(Spiromesifen)

(생   략)

기타농산물	0.05

(374) 알라니카브(Alanycarb)

(생   략)

기타농산물	0.05

(375) 오퓨레이스(Ofurace)

(생   략)

기타농산물	0.02

(376) 트리플루뮤론(Triflumuron)

(생   략)

기타농산물	0.05

(377) 티펜설퓨론메틸(Thifensulfuron -methyl)

(생   략)

기타농산물	0.05

(378) 페림존(Ferimzone)

(생   략)

기타농산물	0.05

(379) 플루아크리피림(Fluacrypyrim)

(생   략)

기타농산물	0.1

(380) 피리달릴(Pyridalyl)

(생   략)

기타농산물	0.05

(381) ∼ (383) (생   략)

(384) 사이플루페나미드(Cyflufenamid)

(생   략)

기타농산물	0.1

(385) (생   략)

(386) 플로니카미드(Flonicamid)

(생   략)

기타농산물	0.1

(387) ∼ (389) (생   략)

(390) 시메코나졸(Simeconazole)

(생   략)

기타농산물	0.05

(391) 만디프로파미드(Mandipropamid)

(생   략)

기타농산물	0.05

(392) (생   략)

(393) 메트알데하이드(Metaldehyde)

(생   략)

기타농산물	0.05

(394) 비스트리플루론(Bistrifluron)

(생   략)

기타농산물	0.2

(395) 플루오피콜라이드(Fluopicolide)

(생   략)

기타농산물	0.1

(396) 에티클로제이트(Ethychlozate)

(생   략)

기타농산물	0.05

(397) ∼ (398) (생   략)

(399) 사이플루메토펜(Cyflumetofen)

(생   략)

기타농산물	0.07

(400) (생   략)

(401) 디비이디시(DBEDC)

(생   략)

기타농산물	0.05

(402) (생   략)

(403) 메타플루미존(Metaflumizone)

(생   략)

기타농산물	0.05

(404) 메트라페논(Metrafenone)

(생   략)

기타농산물	0.05

(405) 사이에노피라펜(Cyenopyrafen)

(생   략)

기타농산물	0.05

(406) ∼ (407) (생   략)

(408) 스피네토람(Spinetoram)

(생   략)

기타농산물	0.05

(409) 아미설브롬(Amisulbrom)

(생   략)

기타농산물	0.05

(410) 옥솔린산(Oxolinic acid)

(생   략)

기타농산물	0.05

(411) ∼ (414) (생   략)

(415) 크로마페노자이드(Chromafenozide)

(생   략)

기타농산물	0.05

(416) 클로란트라닐리프롤(Chlorantraniliprole)

(생   략)

기타농산물	0.05

(417) 플루벤디아마이드(Flubendiamide)

(생   략)

기타농산물	0.05

(418) (생   략)

(419) 프로헥사디온-칼슘(Prohexadione -calcium)

(생   략)

기타농산물	0.05

(420) 린단(Lindane, γ-BHC)

(생   략)

기타농산물	0.01

(421) ∼ (462) (생   략)

[별표 4] ～[별표 6] (생   략)

[별표 3] 농산물의 농약 잔류허용기준

(1) 이미녹타딘(Iminoctadine)

(현행과 같음)

마늘	0.1

파	0.5

<삭    제>

(2) ∼ (4) (현행과 같음)

(5) 노르플루라존(Norflurazon)

(현행과 같음)

<삭    제>

(6) ∼ (8) (현행과 같음)

(9) 델타메트린(Deltamethrin)

(현행과 같음)

<삭    제>

(10) (현행과 같음)

(11) 멥틸디노캅(Meptyldinocap)

(현행과 같음)

감	0.3

오이	0.7

<삭    제>

(12) 디디티(DDT)

(현행과 같음)

<삭    제>

(13) ∼ (14) (현행과 같음)

(15) 디설포톤(Disulfoton)

(현행과 같음)

<삭    제>

(16) ∼ (17) (현행과 같음)

(18) 디캄바(Dicamba)

(현행과 같음)

수수	0.1

(19) ∼ (20) (현행과 같음)

(21) 디클로르보스(Dichlorvos)

(현행과 같음)

사과	0.05

오이	0.1

파	0.1

<삭    제>

(22) ∼ (25) (현행과 같음)

(26) 디페노코나졸(Difenoconazole)

(현행과 같음)

<삭    제>

(27) (현행과 같음)

(28) 디펜아미드(Diphenamid)

(현행과 같음)

<삭    제>

(29) 디플루벤주론(Diflubenzuron)

(현행과 같음)

<삭    제>

(30) ∼ (36) (현행과 같음)

(37) 메카밤(Mecarbam)

(현행과 같음)

<삭    제>

(38) ∼ (45) (현행과 같음)

(46) 메틸브로마이드(Methylbromide)

(현행과 같음)

<삭    제>

(47) (현행과 같음)

(48) 바미도티온(Vamidothion)

(현행과 같음)

<삭    제>

(49) (현행과 같음)

(50) 베나락실(Benalaxyl)

(현행과 같음)

<삭    제>

(51) (현행과 같음)

(52) 벤디오카브(Bendiocarb)

(현행과 같음)

<삭    제>

(53) ∼ (54) (현행과 같음)

(55) 뷰프로페진(Buprofezin)

(현행과 같음)

<삭    제>

(56) ∼ (57) (현행과 같음)

(58) 비에치시(BHC)

(현행과 같음)

<삭    제>

(59) ∼ (60) (현행과 같음)

(61) 비펜트린(Bifenthrin)

(현행과 같음)

<삭    제>

(62) (현행과 같음)

(63) 세톡시딤(Sethoxydim)

(현행과 같음)

<삭    제>

<삭    제>

견과류	0.05†

면실	0.05†

아보카도	0.04†

해바라기씨	0.05†

(64) (현행과 같음)

(65) 사이로마진(Cyromazine)

(현행과 같음)

느타리버섯	3.0

수박	0.1

<삭    제>

(66) ∼ (67) (현행과 같음)

(68) 사이할로트린(Cyhalothrin)

(현행과 같음)

복숭아	0.2

(69) ∼ (70) (현행과 같음)

(71) 아미트라즈(Amitraz)

(현행과 같음)

<삭    제>

(72) ∼ (75) (현행과 같음)

(76) 알드린 및 디엘드린(Aldrin & Dieldrin)

(현행과 같음)

<삭    제>

(77) 알디카브(Aldicarb)

(현행과 같음)

<삭    제>

(78) ∼ (82) (현행과 같음)

(83) 에티온(Ethion)

(현행과 같음)

<삭    제>

(84) (현행과 같음)

(85) 에토펜프록스(Etofenprox)

(현행과 같음)

<삭    제>

(86) ∼ (87) (현행과 같음)

(88) 에트림포스(Etrimfos)

(현행과 같음)

<삭    제>

(89) (현행과 같음)

(90) 엔도설판(Endosulfan)

(현행과 같음)

<삭    제>

(91) 엔드린(Endrin)

(현행과 같음)

<삭    제>

(92) ∼ (100) (현행과 같음)

(101) 이미다클로프리드(Imidacloprid)

(현행과 같음)

<삭    제>

(102) ∼ (105) (현행과 같음)

(106) 이피엔(EPN)

(현행과 같음)

<삭    제>

(107) 키노메티오네이트

(Chinomethionat)

(현행과 같음)

<삭    제>

(108) 티오메톤(Thiometon)

(현행과 같음)

<삭    제>

(109) (현행과 같음)

(110) 카두사포스(Cadusafos)

(현행과 같음)

<삭    제>

(111) (현행과 같음)

(112) 카벤다짐(Carbendazim)

(현행과 같음)

<삭    제>

(113) 카보페노티온(Carbophenothion)

(현행과 같음)

<삭    제>

(114) 카보퓨란(Carbofuran)

(현행과 같음)

바나나	0.01†

(115) (현행과 같음)

(116) 카탑(Cartap)

(현행과 같음)

<삭    제>

(117) 캡타폴(Captafol)

(현행과 같음)

<삭    제>

(118) ∼ (119) (현행과 같음)

(120) 퀸토젠(Quintozene)

(현행과 같음)

<삭    제>

(121) ∼ (123) (현행과 같음)

(124) 클로로벤질레이트(Chlorobenzilate)

(현행과 같음)

<삭    제>

(125) 클로로탈로닐(Chlorothalonil)

(현행과 같음)

<삭    제>

(126) ∼ (128) (현행과 같음)

(129) 클로르펜빈포스(Chlorfenvinphos)

(현행과 같음)

<삭    제>

(130) 클로르프로팜(Chlorpropham)

(현행과 같음)

감자	20

(131) (현행과 같음)

(132) 클로르피리포스-메틸(Chlorpyrifos -methyl)

(현행과 같음)

<삭    제>

(133) (현행과 같음)

(134) 터부트린(Terbutryn)

(현행과 같음)

<삭    제>

(135) 터부포스(Terbufos)

(현행과 같음)

<삭    제>

(136) ∼ (148) (현행과 같음)

(149) 트리플루미졸(Triflumizole)

(현행과 같음)

<삭    제>

(150) ∼ (163) (현행과 같음)

(164) 펜발러레이트(Fenvalerate)

(현행과 같음)

<삭    제>

<삭    제>

견과류	0.15†

(165) ∼ (172) (현행과 같음)

(173) 포레이트(Phorate)

(현행과 같음)

감자	0.05

마늘	0.05

(174) ∼ (175) (현행과 같음)

(176) 포스멧(Phosmet, PMP)

(현행과 같음)

<삭    제>

(177) ∼ (179) (현행과 같음)

(180) 플루실라졸(Flusilazole)

(현행과 같음)

<삭    제>

(181) 플루발리네이트(Fluvalinate)

(현행과 같음)

<삭    제>

(182) 플루시트리네이트(Flucythrinate)

(현행과 같음)

<삭    제>

(183) (현행과 같음)

(184) 프로메트린(Prometryn)

(현행과 같음)

<삭    제>

(185) 프로사이미돈(Procymidone)

(현행과 같음)

<삭    제>

(186) 프로클로라즈(Prochloraz)

(현행과 같음)

<삭    제>

(187) (현행과 같음)

(188) 프로파모카브(Propamocarb)

(현행과 같음)

<삭    제>

(189) ∼ (190) (현행과 같음)

(191) 프로폭서(Propoxur)

(현행과 같음)

<삭    제>

(192) 프로피코나졸(Propiconazole)

(현행과 같음)

옥수수	0.05

(193) ∼ (197) (현행과 같음)

(198) 피페로닐부톡사이드(Piperonyl butoxide)

(현행과 같음)

<삭    제>

(199) ∼ (201) (현행과 같음)

(202) 헵타클로르(Heptachlor)

(현행과 같음)

<삭    제>

(203) ∼ (206) (현행과 같음)

(207) 테부페노자이드(Tebufenozide)

(현행과 같음)

<삭    제>

(208) ∼ (219) (현행과 같음)

(220) 디에토펜카브(Diethofencarb)

(현행과 같음)

<삭    제>

(221) (현행과 같음)

(222) 메파니피림(Mepanipyrim)

(현행과 같음)

<삭    제>

(223) ∼ (227) (현행과 같음)

(228) 아족시스트로빈(Azoxystrobin)

(현행과 같음)

<삭    제>

(229) 카프로파마이드(Carpropamide)

(현행과 같음)

<삭    제>

(230) ∼ (231) (현행과 같음)

(232) 트리사이클라졸(Tricyclazole)

(현행과 같음)

<삭    제>

(233) 펜사이큐론(Pencycuron)

(현행과 같음)

<삭    제>

(234) 펜피록시메이트(Fenpyroximate)

(현행과 같음)

<삭    제>

(235) ∼ (237) (현행과 같음)

(238) 플루디옥소닐(Fludioxonil)

(현행과 같음)

<삭    제>

(239) ∼ (258) (현행과 같음)

(259) 피리메타닐(Pyrimethanil)

(현행과 같음)

<삭    제>

(260) ∼ (290) (현행과 같음)

(291) 족사마이드(Zoxamide)

(현행과 같음)

<삭    제>

(292) ∼ (293) (현행과 같음)

(294) 터부틸라진(Terbuthylazine)

(현행과 같음)

<삭    제>

(295) ∼ (308) (현행과 같음)

(309) 플루톨라닐(Flutolanil)

(현행과 같음)

<삭    제>

(310) ∼ (324) (현행과 같음)

(325) 사이아조파미드(Cyazofamid)

(현행과 같음)

<삭    제>

(326) (현행과 같음)

(327) 오리사스트로빈(Orysastrobin)

(현행과 같음)

<삭    제>

(328) ∼ (361) (현행과 같음)

(362) 트리아자메이트(Triazamate)

(현행과 같음)

<삭    제>

(363) ∼ (369) (현행과 같음)

(370) 벤티아발리카브아이소프로필

(Benthiavalicarb-isopropyl)

(현행과 같음)

<삭    제>

(371) 디니코나졸(Diniconazole)

(현행과 같음)

<삭    제>

(372) (현행과 같음)

(373) 스피로메시펜(Spiromesifen)

(현행과 같음)

<삭    제>

(374) 알라니카브(Alanycarb)

(현행과 같음)

<삭    제>

(375) 오퓨레이스(Ofurace)

(현행과 같음)

<삭    제>

(376) 트리플루뮤론(Triflumuron)

(현행과 같음)

<삭    제>

(377) 티펜설퓨론메틸(Thifensulfuron -methyl)

(현행과 같음)

<삭    제>

(378) 페림존(Ferimzone)

(현행과 같음)

<삭    제>

(379) 플루아크리피림(Fluacrypyrim)

(현행과 같음)

<삭    제>

(380) 피리달릴(Pyridalyl)

(현행과 같음)

<삭    제>

(381) ∼ (383) (현행과 같음)

(384) 사이플루페나미드(Cyflufenamid)

(현행과 같음)

<삭    제>

(385) (현행과 같음)

(386) 플로니카미드(Flonicamid)

(현행과 같음)

<삭    제>

(387) ∼ (389) (현행과 같음)

(390) 시메코나졸(Simeconazole)

(현행과 같음)

<삭    제>

(391) 만디프로파미드(Mandipropamid)

(현행과 같음)

<삭    제>

(392) (현행과 같음)

(393) 메트알데하이드(Metaldehyde)

(현행과 같음)

<삭    제>

(394) 비스트리플루론(Bistrifluron)

(현행과 같음)

<삭    제>

(395) 플루오피콜라이드(Fluopicolide)

(현행과 같음)

<삭    제>

(396) 에티클로제이트(Ethychlozate)

(현행과 같음)

<삭    제>

(397) ∼ (398) (현행과 같음)

(399) 사이플루메토펜(Cyflumetofen)

(현행과 같음)

<삭    제>

(400) (현행과 같음)

(401) 디비이디시(DBEDC)

(현행과 같음)

<삭    제>

(402) (현행과 같음)

(403) 메타플루미존(Metaflumizone)

(현행과 같음)

<삭    제>

(404) 메트라페논(Metrafenone)

(현행과 같음)

<삭    제>

(405) 사이에노피라펜(Cyenopyrafen)

(현행과 같음)

<삭    제>

(406) ∼ (407) (현행과 같음)

(408) 스피네토람(Spinetoram)

(현행과 같음)

<삭    제>

(409) 아미설브롬(Amisulbrom)

(현행과 같음)

<삭    제>

(410) 옥솔린산(Oxolinic acid)

(현행과 같음)

<삭    제>

(411) ∼ (414) (현행과 같음)

(415) 크로마페노자이드(Chromafenozide)

(현행과 같음)

<삭    제>

(416) 클로란트라닐리프롤(Chlorantraniliprole)

(현행과 같음)

<삭    제>

(417) 플루벤디아마이드(Flubendiamide)

(현행과 같음)

<삭    제>

(418) (현행과 같음)

(419) 프로헥사디온-칼슘(Prohexadione -calcium)

(현행과 같음)

<삭    제>

(420) 린단(Lindane, γ-BHC)

(현행과 같음)

<삭    제>

(421) ∼ (462) (현행과 같음)

[별표 4] ～[별표 6] (현행과 같음)